ImageJ快速自动计数细胞数目教程

ImageJ作为一款免费的开源软件,在生物医学领域应用广泛,也是一款定量分析免疫组化图片的利器。ImageJ用于定量分析免疫组化染色图片时,主要的应用可以大致分为两个大方向,一是阳性染色物质的定量,二是阳性染色细胞数目的计数。今天的教程以后者为主。网络上有关免疫组化阳性细胞计数的教程五花八门,但大多数浅尝辄止,普适性不强,而且无法实现大批量图片的分析操作。

在进行免疫组化图片分析时需要指定目标区域,即对ROI准确识别并标记,很多教程都会使用到“Adjust-Threshold”这一步,但每打开一张图片都需要重新调整,过于繁琐且费时。此外,这一步的人为干扰因素太过明显,同一组图片,科研小白和实验老手计算的结果可能天差地别。那么,有没有什么方法能够实现图片分析的批量操作而且避免操作者之间的差异呢?

有!

那就是IHC Toolbox

这款插件最大的好处在于,使用者可以根据自己的染色图片自由训练出专属的图片识别模型。换句话说,实验室或课题组之间批量处理同一种染色图片时,可以share同一个分析模型!这也就意味着实验小白变身老手只在于一个模型!

那么,这款插件该如何应用呢?

本教程将分为“安装-训练-应用”三部分进行讲解。

 

安装IHC Toolbox

这款插件是由英国诺丁汉大学的三位作者共同开发(Jie Shu, Guoping Qiu, Mohammad Ilyas)。插件下载网址在这里:https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ihc-toolbox/index.html

IHC_Toolbox.jar便可以下载了,下载之后不要解压,直接放在ImageJ安装目录中“Plugins”这个文件夹当中即可。或者打ImageJ,直接将下载好的IHC Toolbox拖拽到窗口亦可。

注意事项(避坑tips

1、 官网已经明确说了,ImageJ的版本不能低于ImageJ 1.40p,不符合的只能先升级更新一下再安装;

2、 网站虽然没有明确说明,但是IHC Toolbox的正常使用需要java环境,也就是需要对电脑的系统环境变量进行相应的配置和编辑。这一步不能省略,否则插件无法正常使用。具体的配置方法网络上教程很多,三五分钟搞定。

 

训练模型

安装好IHC Toolbox之后,点击Plugins→IHC Toolbox,即可出现工具箱的操作界面。

 IHC Toolbox操作界面)

打开需要训练的图片,使用ImageJ中的矩形工具选择阳性细胞的细胞核,即“Select ROI”,点击IHC Toolbox操作界面中的“Training”,将会弹出一个“Color Chooser”的对话框。对话框中的横轴便是用于调整阈值的数轴,当确定背景淡去的最佳数值时,点击“Collection”。此时便完成了第一张图片的信息收集,可以打开新的训练图片重复此步骤操作。当收集足够多的图片信息时,点击“Save Model”便可以保存图片模型(格式为txt)。

注意事项(避坑tips

1、 使用矩形工具框选ROI的时候,尽量选择染色满意区域,最好是深染区域,不要留白,区域不宜过大;

2、 网站的模型示例提供了52张图片,如果需要批量处理的图片数目较多(一百张起步),笔者建议训练模型时,不要低于这个数目;

3、 训练模型时,使用高质量的清晰图片,首推高倍率图片;

4、 训练过程中“Color Chooser”窗口不要关掉,训练结束后再一起关闭即可。

 

应用模型计数

IHC Toolbox当中自带四种颜色提取方案,在进行模型训练之前,可以使用系统当中的模式进行初步探索。如果自己已经有训练好的模型,选择“Read User Model”即可。

模型加载完成后,打开新图片,点击“Nuclei”即可,最后会弹出结果框,显示阳性细胞的数目,图片上也有红色的圆圈圈出每个细胞。

这个过程多久呢?主要看分析的图片大小,笔者5M左右的图片每张计数细胞数目时大约费时一分钟。

 

注意事项(避坑tips

1、 选择并加载好模型后,细胞计数时,要选择“Quantification”,若选择“Contour”最后出来的Result Image会有所不同;

2、 “Nuclei Segmentation”的参数有三个,分别为“window size”、“seed size”和“final size”,系统默认设置分别为25/150/150。这三个参数的设定是为了更好地分割聚集的细胞核,网站的示例图片的大小为200 x 200像素,Window size选择了细胞核的半径为参考。在实际应用中,可以根据自己的图片大小对这三个参数进行适当的调整。

在进行大批量操作时,可以将此插件配合ImageJ的宏使用。此时的你,只需要前期训练好模型,后面的步骤便可以交给电脑去完成啦!双手大大地解放了!

很多朋友可能也会问,IHC Profiler跟IHC Toolbox相比如何呢?就笔者自身的使用习惯而言,我更青睐于后者。这两个插件都需要java语言环境,这也是很多教程没有明说的一点。IHC Profiler应用时,对图片的质量要求更高,而且它输出的结果不是细胞数目,而是阳性等级判读,结果并不精确。就冲着可以自主训练模型这一点,IHC Toolbox它难道不香吗?

说在最后的一点,无论是什么工具,好的免疫组化图片都是根本。如果染色搞得一塌糊涂,再好的工具也是无力回天的。当然,IHC Toolbox的应用绝不仅限于此。对于免疫组化染色物质的定量分析、Western Blot条带灰度分析,均可以利用IHC Toolbox轻松完成。插件网站最下端附有开发组已经发表的相关文献,想要了解更多插件功能及开发细节的小伙伴可自行下载文献钻研。如果有兴趣,笔者也可以另开教程进行手把手教学。希望今天的教程能够把你从繁琐枯燥且重复的免疫组化图片分析工作中解救出来,腾出时间去做其他更有意义的事情。
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