为什么宏基因组数据分析比较难?

生物数据分析包括很多种类,比如人基因组,植物,动物,微生物,还有RNA,单细胞RNA等等,其中宏基因组数据分析是比较难的部分,为什么呢?这里总结了以下10点原因。


样品采集

由于微生物在地球上广泛的覆盖,因此,宏基因组样品来源非常广泛,从南北极冰川,到海底淤泥,从喜马拉雅山山脉,到亚马逊丛林,覆盖高山,大河,冰川,土壤,海洋,大气,火山,牛胃,包括人体各个部分都可以进行宏基因组研究,采集到合适的样品,才能开展创新性的研究。

样品提取

由于微生物宏基因组样品种类繁多,可以来自人肠道,山川,河流,土壤,粪便等等样品。因此,很难有统一的样品提取流程。往往无法提取到高质量的DNA而影响后续分析结果。另外,由于样品中可能包括多种物种,例如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,由于二者细胞壁的差别,不同的提取方法都可能造成差异。另外,一些样品中可能包含宿主污染,去除宿主污染也是一大难题。对于宏转录样品,由于原核生物与真核生物 RNA结构不同,也不能采用同样的测序。样品提取一直是宏基因组分析中一项重大难题,需要结合前人经验,以及具体样品,不停的摸索经验。

建库方案

选择不同的建库方案,会对结果造成影响。二代测序需要使用PCR扩增,会带来PCR的偏向性,比如高GC区域无法很好的扩增出来,测序不到,影响后续分析。宏基因组样品由于包含多种GC含量微生物,不同的建库方案会带来差异。

测序成本

尽管随着测序技术的发展,测序价格越来越低。当前测序成本已经下降很多。人全基因组价格已经突破1000美金。但是因为宏基因组测序量数据量大,比如二代测序,每个样本要达到6G以上数据,因此,进行大规模研究,成本依然很高。除了测序费用,后续数据存储,传输,计算等都是不小的费用。

测序技术条件限制

虽然现在的测序技术实现了高通量,可以一次测序环境样品中全部序列。但由于测序读长短,存在测序错误,特异性差,对于物种分类鉴定,基因组拼接都会产生很大的影响。例如,无法完整拼接出样品中包含的全部,完整微生物基因组序列。

数据分析

当前技术条件下,分析单个细菌或者真菌也具有很大的难度。而宏基因组包含未知种类和数目的微生物,并且由于宏基因组测序数据量较大,分析难度也水涨船高。宏基因组数据分析需要微生物学,计算机,统计学等基础。宏基因组分析方法,软件,算法非常多,数据处理过程复杂,分析难度较大。并且很多时候没有标准作为参考,只能摸石头过河。

计算资源

由于宏基因组样品测序量较大,二代测序单个样品一般都需要6G数据以上,有些更多。给数据的存储,传输,计算,分享带来很大困难。物种鉴定,基因组拼接都需要非常大的计算资源,例如多核心CPU(32线程以上),较大的内存(256G内存以上)。计算资源目前依然是宏基因组分析中的瓶颈,很多实验室缺乏足够的计算资源来处理宏基因组数据。另外,由于计算时间较长,不方便反复调整选项参数,得到最优解。

数据库完整性

宏基因组物种鉴定完全依赖已知数据库信息。数据库的完整性直接影响到最终分析结果。当前技术条件下,只测序了一小部分微生物。因此,宏基因组物种鉴定中,还会有大量物种无法鉴定,即使鉴定出没有达到种水平。另外,数据库中结果的准确性也直接影响到鉴定结果。之前一些物种分类错误,这样的问题得不到修正,会逐渐累积下去。

相似物种的干扰

宏基因组样本是一个微生物的混合群落,里面的物种会有来自同一种或者同一属及以上水平的物种,这些物种基因组序列具有相似性,比如基因组同源性达到70%。这会给物种鉴定时测序数据分配,基因组组装测序数据连接造成干扰。例如测序数据分配错误,造成丰度偏差,基因组拼接形成嵌合体序列等,影响分析结果,造成假阳性。

结果可重复性

由于以上宏基因组分析中诸多的影响条件,从样品采集,保存,提取,建库,测序,不同的数据量,选用不同软件,算法,数据库等,都会产生干扰,因此,同样的样品,结果不容易重复。

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