荧光定量PCR实验方法

荧光定量PCR是科研过程中不可缺少的一种实验手段。番茄君还记得自己第一次做荧光定量PCR时,面对着96孔板甚至是384孔板时,十分紧张。即使提前很久计划好了该怎么加样,但是当看到密密麻麻的孔时,还是生怕点错。在加样的过程中,更是小心翼翼,一度怀疑自己。
今天番茄君结合自己的亲身经历,给大家分享一下番茄君在做荧光定量PCR时是如何加样的。
 
下图是一个96孔板,从上到下依次为A,B,C,D,E,F,G,H,从左到右依次为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。一般做荧光定量PCR时,要求三个生物学重复,三个技术重复。现在我们假设有对照组的3个cDNA样品和处理组的3个cDNA样品,一共6个cDNA样品。我们要检测三个目的基因a,b,c的表达量,加上内参基因,一共有四个基因。这样的话,我们需要6(个cDNA)*4(个基因)*3(个重复)=72个孔。孔按10ul的PCR体系,即cDNA 1ul,上下游引物各0.5ul,水3ul,SYBR 5ul
加样前的规划
 
我们按照如下思路加样,如下图所示,每一个红色框里是同一个cDNA(即A1-D3, A4-D6, A7-D9为对照组的3个cDNA,E1-H3, E4-H6, E7-H9为处理组的3个cDNA)。此外,A1-A9和 E1-E9是内参基因,B1-B9和 F1-F9是a基因,C1-C9和 G1-G9是b基因,D1-D9和 H1-H9是c基因。
准备试剂
 
将荧光定量PCR所需要的试剂cDNA, 上下游引物,水,SYBR等准备好。
 
混合cDNA, 水,SYBR
 
根据上面的加样思路,每个红色框里的cDNA,水,SYBR是一样的,同一个cDNA需要加12个孔,我们按照15个孔计算。准备一个EP管,加入cDNA 1μL*15=15μL,水3μL*15=45μL, SYBR 5μL*15=75μL。充分混合均匀,然后每个孔中分别加入9ul混合物。其他红色框同样按上述方法加好。
 
混合引物
 
每对引物需要加18个孔(A1-A9,E1-E9),我们按照22个孔计算,先在一个EP管中加好上下游引物各0.5μL*22=11ul,充分混合均匀,然后在A1-A9和E1-E9中各加入1ul。其余引物同样按上述方法加好。
 
这样加样就完成了,然后贴膜,离心(一定要离心,一定要离心,一定要离心,重要的是说三遍),上机。
 
其实加样方法多种多样,比如也可以先将引物,水,SYBR混合好后点样,再点cDNA(这样的方法适合于cDNA样品比较少的情况)。每个人都有不同的实验习惯,最重要的是做实验之前一定要计划好,做实验的过程中要集中注意力,不要受外界干扰。

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