HBV免疫治疗进展

基于乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染的免疫病理机制,可以采用多种创新策略来增强患者的HBV特异性免疫反应。多种模式识别受体(PRR),如Toll样受体(TLR)、维甲酸诱导基因蛋白I(RIG-I)和干扰素基因刺激蛋白(STING),能够参与HBV的免疫识别。口服、鼻腔或皮下使用PRR激动剂可激活宿主免疫细胞和肝实质细胞及非实质细胞(NPCs),促进IFN和促炎细胞因子的产生,以及干扰素刺激基因(ISGs)的表达。

治疗性疫苗和检查点阻断剂可以诱导和增强HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。过继转移体外活化的T/NKT细胞或基因编辑的HBV特异性T细胞能够更新替代体内耗竭或低能的T细胞,其中最具有代表性的是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和T细胞受体T细胞(TCR-T)。尽管部分作用已经得到了验证,但临床使用之路仍然横亘着重重阻碍。

慢性乙型肝炎(CHB)抗病毒治疗的最终目标是追求以HBsAg丢失为主要特征的“功能性治愈”。但目前可用的治疗策略只能在不到10%的CHB患者中实现“功能性治愈”。临床使用的口服核苷(酸)类似物(NUCs)可抑制HBV复制,安全性高,但很少发生HBsAg清除及血清学转换,停药无期;聚乙二醇干扰素α(PEG-IFN-α)可使10-30%的患者清除HBeAg,并发生HBsAg血清学转换,兼具免疫调节特性;但耐受性差,存在不良反应,以及需要皮下给药。

HBV特异性免疫应答功能障碍被认为是持续感染的主要原因。恢复或增强固有免疫,并诱导HBV特异性适应性免疫应答可能有助于清除HBV。与急性乙型肝炎相比,慢性乙型肝炎(CHB)的免疫应答具有以下特点:HBV特异性CD4⁺/CD8⁺ T细胞、DCs和NKs/NKTs功能障碍或数量减少;免疫检查点蛋白程序性死亡受体1(PD-1,CD279)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4,CD152)、T细胞免疫球蛋白黏液素3(Tim-3,CD366)等负性调节因子表达上调;固有免疫应答受损,TLR下调和失活。

在HBV感染过程中,肝免疫系统首先对门静脉的抗原产生耐受。受损的肝细胞释放精氨酸酶和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)等,消耗维持T细胞功能所需的氨基酸,从而抑制T细胞功能。肝内炎症募集调节性T细胞(Treg)、B细胞和骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs),并激活星状细胞,产生IL-10和TGF-β。肝脏的免疫抑制可避免炎症引发的严重损伤,但也损害了HBV特异性T细胞的功能。高水平的HBV DNA、HBsAg和HBeAg有助于维持CHB患者的HBV特异性免疫耐受。目前已经证明,从抗-HBs阳性供体中过继转移骨髓可在受体中实现HBV清除;肝移植可将免疫细胞从接种疫苗的供体转移到受体,并部分控制肝脏的再感染。这些发现提示,免疫调节具有治疗HBV感染的潜力,越来越多的研究开始探究小分子等免疫治疗策略。

01

增强固有免疫以建立抗病毒状态:临床前研究

 

模式识别受体激动剂:

TLR配体:TLRs广泛表达于免疫细胞和肝实质/非实质细胞,可识别病毒和细菌的病原体相关模式分子(PAMPs),在固有免疫中发挥重要作用,并衔接适应性免疫。Isogawa等首先证明,对HBV转基因小鼠模型单独使用TLRs-3、4、5、7和9的特异性配体,可在24小时内以非细胞毒性的、IFN依赖性的方式抑制肝内HBV复制。TLR配体可通过IFN依赖性和非依赖性途径有效抑制原代肝细胞和肝癌细胞中的HBV复制。TLR-2和4的激动剂在肝癌细胞和土拨鼠肝细胞中能够抑制土拨鼠肝炎病毒(WHV)复制。用TLR配体刺激NPCs(KCs和LSECs)和DCs可诱导一系列抗病毒因子(如I型IFN)的合成,在体外抑制HBV复制。TLR激动剂不仅可以激活肝脏中的实质细胞、NPCs和浸润的免疫细胞,还可以募集循环中的免疫细胞以建立抗病毒状态。TLR激动剂主要诱导炎性细胞因子和趋化因子应答。最近有研究发现,TLR激动剂可通过代谢调节直接促进T细胞功能。但需要考虑TLR激动剂带来的全身炎症反应。

TLR-9 的天然配体是病毒和细菌基因组中的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸序列 (CpG)。连续16周,每周向慢性感染WHV的土拨鼠皮下注射CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)可诱导IFN的合成,出现较弱的短暂病毒抑制作用。有研究表明,CpG ODN可以增强抗病毒治疗的效果。

GS-9620是TLR-7的一种配体,已在土拨鼠和黑猩猩模型中展现出了治疗潜力;GS-9620可在人PBMCs中诱导多种HBV抑制因子,延长PHH和HepaRG细胞中I型IFN相关的HBV抑制作用,增强免疫蛋白酶体亚基的合成,并可能暴露感染HBV的PHH中的一种免疫优势病毒多肽,促进宿主的T细胞识别和激活并控制病毒。

图1. GS-9620作用机制

【Niu C, Li L, Daffis S, et al. Toll-like receptor 7 agonist GS-9620 induces prolonged inhibition of HBV via a type I interferon-dependent mechanism. J Hepatol. 2018;68(5):922‐931. doi:10.1016/j.jhep.2017.12.007】

RIG-I激动剂:SB9200是RIG-I和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(NOD2)的激动剂。WHV感染的土拨鼠口服该激动剂12周后可延长血液/肝中IFN-α/β和ISG的活化,降低血清WHV DNA和WHsAg;在使用恩替卡韦(ETV)后序贯使用SB9200可以更显著地抑制WHV,延迟病毒复制的复发。因此,SB9200诱导的宿主应答增强了NUCs的抗病毒效应。

STING激动剂:宿主的环状GMP-AMP合成酶(cGAS)可以识别HBV DNA并激活其接头蛋白STING,促进ISG56表达并抑制病毒组装。双链DNA(dsDNA)或环鸟苷酸-腺苷酸(cyclin GMP-AMP, cGAMP)激活cGAS-STING通路,可显著抑制细胞和小鼠模型中HBV的复制。小鼠STING的激动剂5,6-二甲基黄嘌呤酮-4-乙酸(DMXAA)在水压动力构建的HBV小鼠模型中显著诱导ISG的表达并减少肝脏HBV DNA的产生。DMXAA主要诱导I型IFN主导的细胞因子反应。人肝细胞中STING的表达尚存争议。用cGAMP或DMXAA处理感染HBV的肝癌细胞可显著抑制HBV复制,胞内HBV mRNA、核心相关DNA和分泌的HBsAg降低,但cccDNA数量无明显改变。

MITA(Mediator of IRF3 activation)相关蛋白(MRP)是MITA/STING的剪接异构体,可特异性阻断MITA相关的IFN激活,同时仍诱导NF-κB通路。MRP过表达小鼠的HBV复制受到抑制;反之,MITA/STING缺陷增强了小鼠的HBV复制。MITA/STING缺陷动物的HBV特异性体液免疫应答和CD8⁺ T细胞应答减少,表明MITA/STING在抗HBV免疫的固有和适应性应答中发挥重要作用。总而言之,STING有望成为CHB免疫治疗的靶点。

图2. 增强固有免疫并建立抗病毒状态的方法。激活固有免疫可诱导抗病毒和炎性介质的产生,并在不同程度上抑制病毒;适应性免疫也不可或缺。目前只有TLR7配体GS-9620已在临床试验中进行了测试。

APOBEC调节的脱氨:载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽 (APOBEC) 家族是一类高效的胞苷脱氨酶。其中,APOBEC-3参与宿主对HBV的固有免疫,最早在2005年报道人APOBEC-3能够通过胞苷脱氨作用编辑HBV DNA。在感染HBV的HepAD38和HepG2.2.15细胞中,内源性胞苷脱氨酶可以编辑病毒衣壳内10–25%的HBV rcDNA基因组。热休克蛋白90(Hsp90)可增强APOBEC-3介导的HBV DNA脱氨活性。APOBEC-3酶可能通过胞苷脱氨作用介导I型IFN和淋巴毒素的抗病毒活性,从而导致cccDNA降解。

图3. 高剂量IFN-α处理或LTβR激活分别上调A3A和A3B的表达,随后它们在感染的肝细胞中与HBV核心蛋白共定位或直接相互作用,移位到细胞核,在HBV核心蛋白的作用下与cccDNA紧密接触。APOBEC可以使在转录过程中瞬时变成单链的cccDNA脱氨基。HBV cccDNA中的尿嘧啶被细胞DNA糖基化酶识别并切除,导致脱嘌呤嘧啶(Apurinic/Apyrimidinic,AP)位点的形成;AP 位点被细胞AP核酸内切酶识别,cccDNA因此被降解。

【Lucifora J, Xia Y, Reisinger F, et al. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science. 2014;343(6176):1221‐1228. doi:10.1126/science.1243462】

02

诱导HBV特异性免疫应答

(1)蛋白质/多肽疫苗:

HBsAg/preS疫苗:常规HBsAg疫苗在动物模型或CHB患者中治疗效果不理想,这归因于HBsAg特异性免疫耐受。而使用IL-12作为佐剂时,HBsAg免疫接种可有效逆转HBV感染小鼠对HBV蛋白的系统性耐受,HBV特异性CD8⁺/CD4⁺ T细胞应答增强,CD4⁺ Foxp3⁺ Treg细胞减少。大多数接种基于IL-12的疫苗的动物血清HBsAg转阴,肝细胞中HBcAg低于检测下限。preS1多肽也可以增强HBV感染小鼠的免疫应答。序贯使用preS1和HBsAg疫苗,抗preS1抗体可以清除HBV病毒颗粒,甚至引起HBsAg/HBsAb血清学转换。

HBcAg疫苗:在HBV复制得到控制的CHB病例中,HBcAg特异性CTLs水平显著升高,因此基于HBcAg的疫苗有望用于治疗CHB。含有HBcAg aa18–27和Th表位的疫苗在CHB患者中激发了低水平的CTL活性,但未能清除HBV。

HBsAg/HBcAg复合疫苗:在野生型C57BL/6小鼠和HBV转基因动物中,包含HBsAg、HBcAg和CpG佐剂的治疗性疫苗可引起强烈的HBsAg/HBcAg特异性体液免疫应答,对HBsAg的Th1/Th2应答以及对HBcAg的Th1型应答保持平衡。HBsAg/HBcAg特异性细胞免疫应答增强,可显著降低HBV转基因小鼠的血清HBsAg水平,且不导致肝损伤。HBsAg、HBcAg和佐剂ISCOMATRIXTM组成的疫苗可以在HBV转基因(HBV-Tg)小鼠中诱导多特异性和多功能T细胞,特别是HBc特异性CD8⁺ T细胞,使IFN-γ、TNF-α和IL-2产量增加。4次接种后,8只动物中有7只抗-HBs滴度超过10000 IU/L;在2次和4次接种后,HBV-Tg小鼠外周血HBV DNA减少,但没有统计学意义。HBcAg阳性肝细胞也显著减少,无明显肝损伤。

抗HBsAg抗体:抗体介导的免疫疗法已在多项临床前及临床研究中被评估,未展现出长效的HBV抑制作用。针对HBsAg的单克隆抗体(mAb E6F6)可在多种小鼠模型中有效抑制持续性HBV复制,在HBV转基因动物中显著减少HBsAg和HBV DNA,效果长达数周。在人肝嵌合小鼠模型中,E6F6不仅可以有效预防原发性HBV感染,而且可以减少被感染肝细胞的继发性HBV传播。水压动力注射建立的HBV持续复制的小鼠经过基于E6F6的免疫治疗后,抗HBV T细胞应答得以恢复。依赖Fcγ受体的吞噬作用被认为在E6F6相关的病毒免疫清除中发挥最关键的作用。

DNA疫苗:编码HBsAg和HBcAg的DNA疫苗可诱导针对这两种HBV抗原的体液免疫和细胞免疫应答。在肌肉和皮下注射疫苗后,肌细胞和抗原提呈细胞原位表达的HBsAg和HBcAg被处理并呈递给宿主免疫细胞,激活特异性B和T细胞。动物实验表明,多种方法可以提高DNA疫苗的效力,如整合免疫刺激性细胞因子、与NUCs联用、初免-加强免疫方案、电穿孔递送、检查点阻断等。

基于病毒载体的疫苗:多项研究表明,基于病毒载体(如水泡性口炎病毒,VSV)的疫苗在诱导T细胞方面优于其他类型的疫苗。

总而言之,目前可用的疫苗在临床前或临床研究中收效甚微。如何将活化的免疫细胞募集到肝脏中,并在肝脏中维持和增强HBV特异性免疫,仍是需要克服的难题。

(2)HBV特异性T细胞疗法:

DC疫苗:DC细胞是最强大的抗原提呈细胞,在固有免疫与适应性免疫之间发挥重要作用。在免疫移植实验中,髓样DCs(mDCs)能够调节HBV特异性CD8⁺ T细胞的功能分化。CD40刺激mDCs可恢复T细胞功能。在HBV转基因小鼠模型中,HBsAg激发的DCs可以诱导HBsAg特异性免疫应答;HBcAg激发的DCs诱导HBsAg和HBcAg特异性T细胞应答,从而导致HBsAg丢失与抗-HBs血清学转换。

CIK/DC-CIK:细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞是通过用IFN-γ、抗CD3抗体、IL-1和IL-2离体处理PBMC或脐带血单核细胞产生的,兼具T和NK细胞样表型(CD3⁺ CD56⁺)。CIK细胞以MHC限制性和非限制性方式靶向被感染细胞和癌细胞,诱导快速和普遍的免疫反应。DC-CIK指CIK细胞与DC细胞共培养,或自体DCs和CIKs的序贯过继转移。DCs(尤其是抗原激发的DCs)可以刺激NK细胞并启动抗原特异性T和B细胞应答。越来越多的证据表明,DCs的加入可以减少CIK细胞培养中的调节性T细胞的数量,并增加CD3⁺ CD56⁺细胞比例。

免疫检查点抑制剂:免疫检查点(如PD-1/PD-L1信号通路)的阻断剂可以减轻特异性T细胞的负性调节作用,或者复苏耗竭的T细胞。近期的一项离体研究表明,使用OX40刺激联合PD-1通路阻断剂可增强HBV特异性CD4⁺ T细胞的功能。在HBV携带者中,PD-1阻断剂可恢复病毒特异性的CD8⁺ T细胞;其它检查点分子(如Tim-3和CTLA-4)的阻断剂也可恢复CHB患者病毒特异性CD8⁺ T细胞应答。

基因编辑的T细胞(CAR/TCR-T):CHB患者因为不同的免疫耐受机制,缺乏有效的T细胞应答以清除病毒。目前基于T细胞的疗法使用功能良好的T细胞库取代或增强宿主体内低能或耗竭的T细胞库,并靶向病毒特异性免疫优势表位,有望长效控制HBV感染。但这种疗法也存在着一些问题,如T细胞介导的强大杀伤作用可能导致严重的肝损伤和急性肝衰竭;以及需要证明工程化的T细胞功能得到改善,且在肝脏的免疫耐受条件下仍可保持功能。

改造的CAR-T细胞可以非MHC依赖的方式识别抗原,与天然T细胞相比有着更为广阔的靶点。Bohne等研发出靶向HBsAg的CAR-T细胞,针对HBsAg的“a”决定簇和preS1蛋白的aa37-43,识别HBsAg阳性的人原代肝细胞和HepG2.2.15细胞,并特异性清除被HBV感染的靶细胞。HBV-TCR-T细胞、HBsAg-CAR-T细胞等正处于细胞/动物实验中。

图4. 诱导HBV特异性免疫应答和重新控制HBV感染的策略。

03

当前基于免疫疗法的临床试验

已有多种免疫疗法投入动物实验,但只有部分进入了临床试验阶段。一些疗法在土拨鼠模型中发挥了作用,但在慢乙肝患者身上却未能奏效。

表1. 基于免疫疗法的现有临床研究。

GS-4774是基于酵母菌的重组疫苗,包含HBV特异性抗原(如HBx蛋白和HBsAg大蛋白)。GS-4774的安全性、耐受性和免疫原性已在健康受试者中得到验证,但在Ⅱ期临床试验中,GS-4774未能抑制CHB患者体内的病毒,HBsAg未显著减少。总之,尽管GS-4774能够刺激宿主CD8⁺ T细胞,但不足以控制HBV。

鼻疫苗候选药(NASVAC)由HBsAg和HBcAg组成,目前已进入III期临床随机对照试验,疗效略优于Peg-IFN,还需要进一步验证。

HBsAg-乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)复合物(YIC)已通过II期临床试验。在HBeAg阳性的CHB患者中,YIC接种组与对照组相比,HBeAg血清学转换率升高,病毒载量降低。但是,III期临床试验没有呈现出令人满意的结果。

HepTcell是包含HBV特异性T细胞表位的九种合成肽的混合物。在英国和韩国进行的I期临床试验中,向接受ETV或TDF治疗的HBeAg阴性CHB患者注射HepTcell三周,耐受良好,并能诱导针对患者体内HBV抗原的细胞免疫应答。

DNA疫苗的安全性已在I/II期临床试验中得到验证,但与NUCs联用收效甚微。在接受拉米夫定治疗的HBV携带者中,含有大部分HBV基因组和IL-12 DNA的DNA疫苗能够产生病毒学应答。携带HBsAg、HBcAg和聚合酶(TG1050)的非复制型腺病毒载体在小鼠模型中展现出强烈的HBV多特异性和T细胞应答延长的特点。一项Ib期研究证明了TG1050的安全性和免疫原性,有望在将来与抗病毒药物联用。

抗PD-1抗体Nivolumab单抗已进入Ib期研究,单独给予Nivolumab单抗或与GS-4774联用均可以在12周降低HBsAg水平。

目前有多种口服TLR-7/8激动剂正在进行临床试验,包括GS-9620、RO7020531、RG7795(ANA773)、RG7854、JNJ-4964(AL-034/TQ-A3334)和GS-9688。GS-9620的安全性已经得到了验证,但GS-9620并不能显著降低HBsAg水平,其疗效还有待进一步评估。TLR-7激动剂RO7020531正处于I期临床试验之中。

AIC649是已获得专利的灭活副痘病毒(iPPVO),可以诱导对非相关病原体的、自然自限的免疫反应。使用AIC649后,即便停药,土拨鼠模型体内的WHsAg也显著减少。

此外,DC/DC-CIK也已经投入了临床研究,但还需要更多的随机对照研究来验证其疗效。

总之,基于免疫疗法的临床试验尚未取得令人满意的结果,免疫疗法不仅需要诱导适应性免疫,还需要克服病毒慢性感染过程中的负性免疫调节。

04

基于IFN-α的免疫疗法

PEG-IFN-α具有抗病毒和免疫调节作用,仍然是治疗CHB患者最有效的药物。PEG-IFN-α会促进HBsAg的丢失,尤其是在给予NUCs且HBsAg滴度小于1000 IU/mL的患者中。若将Peg-IFN-α多样化地整合到多种药物方案中,例如降低剂量或间歇使用以避免严重的不良反应,则可能对HBV感染的治疗作出重要贡献。

Peg-IFN-λ是一种III型IFN,被认为对CHB的固有免疫和适应性免疫具有双重的免疫调节作用。IFN-λ与IFN-α具有相似的ISG诱导途径,抗病毒作用相似。因为IFN-λ结合的干扰素受体被限制在上皮来源的细胞(如肝细胞),预期PEG-IFN-λ的耐受性可能会优于PEG-IFN-α。

图5. HBV生命周期及抗HBV相关ISGs的作用阶段。

【引自杨舒雅,向宽辉.乙型肝炎病毒感染与干扰素介导的固有免疫应答的研究进展[J].中国病毒病杂志,2019,9(04):303-310.】

总结

慢性HBV感染被认为是HBV特异性免疫耐受的结果。因此打破免疫耐受并恢复HBV特异性免疫反应有助于患者控制和清除HBV。但到目前为止,基于该策略的尝试效果并不理想,还存在肝损伤的风险。因此,未来需要将有效的抗病毒治疗和精心设计的免疫调节相结合。

近几年对HBV特异性T细胞介导的抗病毒作用研究较多,B细胞和NK细胞也还需要更多的关注。多种宿主基因决定因素有助于抑制HBV,如UBE2L3基因可通过控制cccDNA稳定性和未知过程调节HBV复制。

cccDNA和/或整合的HBV DNA在肝细胞中对于HBV慢性感染的“功能性治愈”具有重要影响。免疫疗法有可能清除大部分具有cccDNA和/或整合HBV DNA的感染肝细胞,从而降低肝癌发生发的风险。

Seminar: “Immunobiology of Chronic Hepatitis B” Mala Maini PhD FRCP FMedSci

文献来源

Meng Z, Chen Y, Lu M. Advances in Targeting the Innate and Adaptive Immune Systems to Cure Chronic Hepatitis B Virus Infection. Front Immunol. 2020;10:3127. Published 2020 Feb 7. doi:10.3389/fimmu.2019.03127

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