Western Blot无条带或条带位置异常?解析及对策

Western Blot(蛋白免疫印迹法,简称 WB)作为生命科学研究领域最常用、最知名的实验之一,做好却并非易事。要么条带失踪,要么背景漆黑,要么杂带丛生……看着别人家赏心悦目的实验结果,你酸了吗?为了帮大家绕开各种大坑,我们精心整理出避雷指南,快快收藏。

无条带:众里寻他千百度

♦ 样品原因

首先需要确定样品中目的蛋白是否有足量的表达,不同组织、细胞乃至不同刺激情况下,目的蛋白的表达量可能差异很大。可以通过查询 Uniprot、The Human Protein Atlas 等数据库以及参考文献,对目的蛋白的丰度有一个预期。如果无法找到目的蛋白在样品中丰度的直接参考数据,还可以通过信号通路上下游蛋白或者目的蛋白 mRNA 水平来侧面判断。

The Human Protein Atlas 示例 Human GAPDH 蛋白在各组织中的表达丰度

需要注意的是,mRNA 水平并不一定与目的蛋白的丰度呈正相关。若低丰度蛋白,可以考虑增加样品上样总量或者抗体的浓度,提高曝光时间等以增强信号,或者利用免疫沉淀法(IP)对目的蛋白进行富集后再进行检测。

其次需要考虑到蛋白的定位,针对低丰度的膜蛋白或核蛋白等,可以使用特定的蛋白提取方法对目的蛋白进行富集。选择错误的裂解液会造成样品中无目的蛋白情况,例如目的蛋白为核蛋白时请勿使用 NP40 这类温和的裂解液。

表格:针对不同蛋白定位选择合适的裂解液

如果是分泌型蛋白,例如细胞因子或趋化因子等,组织或者细胞的裂解液可能并不能直接反映目的蛋白的表达水平,一方面可以通过刺激处理促进其胞内表达,另一方面可以尝试 ELISA 或者 Luminex 多因子检测等实验方法对细胞上清液或者生物体液等进行检测。

Uniprot 示例 Human IL-6 蛋白的定位信息,主要在胞外或分泌(左图);WB 检测 RAW 264.7 细胞系中未用(LPS)处理(-)或处理过(+)的 IL-6 的表达,抗体使用 Mouse IL-6 Antibody(货号 AF-406-NA)。

此外,样本收集及保存过程中,需要考虑目的蛋白降解的风险,建议使用新鲜的裂解液对新鲜收集的样本进行蛋白提取,并确保裂解液中蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂活性,防止蛋白降解。样本尽量低温保存,并避免反复冻融。

♦ 抗体原因

抗体的选择或保存错误也可能造成 WB 结果无条带。可以先检查抗体是否在正确的储存条件下保存并在保质期内使用。若收到的抗体为冻干粉(Lyophilized)状态,需要注意使用正确的重溶(Reconstitution)操作以保证抗体的活性。

使用目的蛋白高表达的样本或者重组蛋白作为阳性对照可以检测抗体是否失活,抗体与抗原亲和力不足也可能造成无条带情况。可以使用斑点杂交实验(Dot Blot)验证抗原抗体体系是否有效或抗体是否失活,并确定抗体的起始浓度。此外,单克隆抗体与多克隆抗体对于抗原表位识别的差异也可能对 WB 结果产生影响。

还有一点需要注意:应用于 WB 的常见抗体识别抗原的线性表位,因此上样缓冲液(Loading Buffer)中通常都含有还原剂(Reducing Reagent)例如二硫苏糖醇(DTT)或 β 巯基乙醇(2-ME)等,能够打开蛋白的二硫键产生线性表位。部分抗体识别的抗原表位为构象表位,使用此类抗体进行 WB 需要选择非还原(Non-reducing)条件处理样品,即不加入还原剂,从而保留蛋白的空间构象,否则会导致无法识别。

♦ 转膜原因

根据目的蛋白分子的亲水性/疏水性及分子大小选择合适的膜,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜更适用于亲水性的蛋白,硝酸纤维素(NC)膜更适用于疏水性的蛋白;大于 20 kDa 的蛋白使用 0.45 μm 的膜,小于 20 kDa 的蛋白使用 0.2 μm 的膜。

表格:几种 WB 常用膜的区别

还需要检查转膜条件,确保 PVDF 膜或硝化纤维素(NC)膜在浸入转膜缓冲液前在预冷的甲醇中充分浸泡过;确保膜与凝胶之间有接触良好,无气泡等干扰。

可以使用考马斯亮蓝或者丽春红染凝胶或者使用预印染 Marker 确认转膜是否正常;对于高分子量蛋白可以适当延长转膜时间,对于低分子量(小于 20 kDa)蛋白建议选择孔径较小的膜,使用湿转法,同时注意降低转膜电压或减少转膜时间。

♦ 缓冲液原因

封闭时间过长可能影响抗原抗体的结合,建议封闭时间为常温 1~2 小时,并减少封闭液中的蛋白浓度。此外,需要确保缓冲液中不含有叠氮化钠等成分,其能够影响辣根过氧化物酶(HRP)活性。

需要注意的是,如果目的蛋白等电点较高(大于 9)时,需要使用 pH 值更高的缓冲液体系例如 CAPS(pH 10.5)。蛋白的等电点可以通过文献查询或者基于蛋白的氨基酸序列进行预测,推荐工具网站:ExPASy。

♦ 显色剂或二抗原因

确保显色剂及二抗活性正常,使用新鲜的显色剂现配现用。检查二抗的选择是否正确,需要注意一抗的种属及免疫球蛋白类型及亚型。优先选择识别免疫球蛋白重链与轻链(H+L)的二抗。

抗体结构及抗体亚型

条带位置异常:拨开迷雾见月明

WB 实验结果基于蛋白的大小,通常蛋白分子量越小,它在凝胶中的迁移速度越快。然而,迁移也受到其他因素的影响,因此实际观察到的条带大小可能与预测的不同。包括以下一些常见原因:

1. 凝胶与 Marker 等差异导致的轻微偏移建议根据目的蛋白的大小选择合适的凝胶浓度,并且尽量选择知名厂商的 Marker。

不同分子量大小目的蛋白推荐使用的凝胶浓度

2. 目的蛋白存在翻译后修饰,需要查询数据库及文献资料,了解目的蛋白是否存在翻译后修饰,例如磷酸化、糖基化、泛素化修饰等,这些均可能影响条带的位置。

大鼠 SOD3 蛋白预测分子量为 27 kDa,Uniprot 示例此蛋白含有糖基化位点(左图),文献报道显示大鼠脑组织中 SOD3 有 130、80、50 kDa 多处条带(右图,来源 doi: 10.1007/s12035-015-9587-2)。

3. 翻译后剪切:许多蛋白首先是以前体形式合成,之后通过剪切形成活性形式,大小也随之改变。例如 Human IL-1β 前体蛋白(precursor),经过 CASP1 酶剪切后,形成 Human IL-1β 蛋白。

Uniprot 示例 Human IL-1β 由 Human IL-1β 前体蛋白剪切而来。

4. 目的蛋白可能存在多种异构体(Isoform),同一基因不同的内含子剪接可能产生不同大小的剪切体(Spliced variant),需要查询数据库及文献资料,了解目的蛋白是否有异构体,及是否含有抗体能够识别的表位。

Uniprot 示例 Human EPOR 蛋白存在 3 个剪切异构体,大小分别为 26, 36, 55 kDa。

5. 目的蛋白存在二聚体或多聚体形式,选择抗体识别的抗原表位不同以及是否使用还原状态会影响实际条带的位置。

6. 目的蛋白降解(Degradation),尽量使用新鲜样本,储存前加入蛋白酶抑制剂并减少样本的冻融次数。

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