【新手攻略】慢病毒转染全攻略

稳定转染细胞株可应用于重组蛋白、抗体生产、基因编辑、功能性研究和移植瘤构建等多种实验,已成为我们日常实验操作的一部分。但是很多同学也会一直为这个实验愁眉苦脸,遇到加入慢病毒后细胞状态差或者死亡GFP的亮度弱转染效率低下的问题。整个慢病毒转染实验周期耗时长,对后续实验影响大,下面笔者提供一份慢病毒转染全攻略,助你在慢病毒转染实验中乘风破浪。
一. 慢病毒包装
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1作为基础发展起来的基因治疗载体,具有能稳定表达外源基因、感染谱广泛、有效感染处于分裂期和静止期的细胞等优点,成为导入外源基因的有效工具。慢病毒已被广泛应用到各种细胞系基因过表达、RNA干扰、miRNA研究以及活体动物实验中。
慢病毒包装过程一般为构建慢病毒表达载体大量扩增慢病毒载体在293T细胞内进行慢病毒载体的大量包装慢病毒的浓缩及纯化慢病毒滴度测定。但现在笔者所在的高校很多课题组已经不再个人进行这个实验了,一般都直接从公司购买测定好滴度的慢病毒。笔者提供一篇文献:PMID: 30505888,里面详细描述了整个慢病毒包装的实验材料和步骤,可供大家参考。

慢病毒包装过程(PMID: 30505888)
二.慢病毒的储存与稀释
1. 病毒液储存:如果短时间(3天)内进行实验,可以将病毒液暂放置4℃保存;如不能在短期内全部使用,需将慢病毒液分装后置于80冰箱保存(根据每次的使用量进行分装,将定量的病毒液置于冻存管中,做好日期和储存量标记,封口膜密封)。病毒液可存放于-80℃冰箱约6个月,如储存时间超过6个月,可在使用前重新测定病毒滴度
2. 病毒液稀释:将病毒液取出,置于冰上融解,使用PBS或培养目的细胞的无血清培养基稀释。 

病毒稀释过程(图片源于吉凯基因)
三.慢病毒感染细胞实验步骤
慢病毒对不同细胞系亲嗜性不同,在使用慢病毒前可以查阅相关文献,了解慢病毒对目的细胞系的感染复数MOI值(MOI在用于病毒感染细胞的研究中时,含义是感染时病毒与细胞数量的比值。如果无相关文献支持,可以通过预实验获取合适的MOI值。 
以24孔培养板为例,进行目的细胞系和293T细胞(平行对照)的感染预实验,按照不同的MOI值设置若干感染孔(可依据经验值设置3个左右梯度),并根据MOI值和细胞数量计算所需要的病毒量,如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 
(1) Day 1,准备细胞:在 24 孔培养板接种若干孔处于对数生长期的目的细胞和平行对照293T细胞,铺板时细胞融合率为50%左右,每孔加入100 μL培养基,培养箱中培养至细胞贴壁(针对贴壁细胞),进行病毒感染时细胞的最佳融合度为 70% 左右。
(2) Day 2,准备病毒: 4°C保存的病毒,取出后轻轻用移液器混匀; -80℃冻存的病毒在冰上融化后使用。
接着感染目的细胞:从培养箱中拿出细胞,观察细胞生长状态,如细胞状态好(细胞状态对转染影响较大),则可以开始实验。
a.吸去培养器皿中的旧培养基,用PBS清洗两次,更换新鲜培养基(如果细胞生长良好,没有大量漂浮细胞,培养基没有变色,则不用换液)。
b. 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入目的细胞和对照细胞中。
c.将病毒液和培养基混匀,放于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2)孵育培养。
(3) Day 3(加入病毒液 24 小时后),弃去含病毒的培养液,换上新鲜完全培养液,继续在培箱中进行培养(该时间可根据实验情况具体调整,笔者所在课题组为8小时换液)
(4) Day 4(加入病毒 48-72小时后),对于带 GFP 报告基因的病毒,可通过荧光显微镜观测 GFP 荧光强度,对于携带 Puromycin 抗性基因的病毒,换上含适当浓度Puromycin完全培养液(Puromycin 标准终浓度范围为 1-10 μg/mL,不同细胞系Puromycin工作液浓度不同,可查阅文献或者预实验寻找最适Puromycin筛选浓度),筛选出稳定表达的细胞株。

转染48小时HepG2 细胞GFP荧光强度
(5) 稳定细胞株筛选:Puromycin筛选后的细胞进行传代,并继续持续施加合适浓Puromycin 维持抗性,连续筛选并传3代后,冻存保存稳定表达细胞株。
四.慢病毒感染注意事项
1. 进行病毒操作时最好使用专用生物安全柜避免污染
2. 必要时可使用病毒感染增强剂来提高病毒感染效率(Transdux),笔者所在课题购自SBI(https://systembio.com/shop/transdux-max-lentivirus-transduction-enhancer/)。

图片来源于SBI官网
3. 在转染后,如果目的细胞系GFP荧光强度弱,可观察293T平行对照组荧光强度,如果293T荧光强度也弱,需要考虑病毒液本身的问题,如果293T荧光强度正常,就需要考虑是不是目的细胞系属于难转染细胞系等其他原因
4.在转染过程中常常遇到加入病毒液后或者加入Puromycin筛选后细胞状态极差的情况,这个时候细胞通常比较脆弱,在已经确定好病毒液的量或者Puromycin筛选浓度时,多考虑是不是在转染时细胞本身状态不够好(比如笔者遇到过传多代的细胞会难转染的情况)。
5.如果加Puromycin后细胞死亡较多,需要及时换液,以防死细胞释放的有害物质影响具有抗性的细胞生长。
6.像HepG2细胞具有聚集生长的特性,如果加Puromycin后死亡的细胞较多,剩下的HepG2细胞比较稀松,细胞也很难长起来。
以上为笔者的一些个人实验经验,不代表所有实验情况,总之希望大家在平时的实验过程中都多交流,多查阅相关文献资料,早日出成果。
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