miRNA结合细胞交互的外泌体研究思路

大家好,我是先锋班学员水主沉浮。
 
2020年发表在Biomater Science的一篇名为《Exosomal MIRNA-486-5P derived from rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes induces osteoblast differentiation through the Tob1/BMP/Smad pathway》的文章,影响因子竟然达到6.183,PMID:32406432
 
众所周知,随着lncRNAcircRNA兴起,miRNA已经渐渐失宠。本文作者虽然是把已经过气的分子——miRNA作为本文主变量但是却套上了细胞交互的外泌体,再靠上一个明星通路,就稳稳地过了5分!
 
来,跟着我的脚步,我们一起来仔细分析分析作者用了什么样的“新”套路吧~
 
(后台回复:36,即可查看酸菜总结的更多套路)
 

▽▼▽

 
一. 题目四要素:
主变量分子是miRNA-486-5p;表型是成骨细胞分化;疾病是类风湿关节炎(RA);机制是通过Tob1/BMP/Smad途径。
二. 文章结构:
本文包括分子、细胞、组织、动物四个维度的数据,正文部分一共7张图片,补充材料中仅有一张图片,主要是提取原代细胞的过程。文章内容包括以下部分:
第一部分,验证表型(Fig1、2):
 
1.RA-FLSS来源的RA-FLSS-exo抑制RA成骨细胞分化
2.含miR-486-5P的RA-FLSS-exo促进RA成骨细胞分化
第二部分,寻找机制(Fig3、4、5、6):
 
3.RA靶向Tob1的RA-FLSS-exo载体miR-486-5P
4.MiR-486-5p通过降低Tob1表达促进成骨细胞分化
5.含miR-486-5P的RA-FLSS-exo通过抑制Tob1激活BMP/Smad信号通路促进成骨细胞分化
6.含miR-486-5P的RA-FLSS-exo通过抑制Tob1减轻CIA诱导的RA
注释
(RA-FLSs,rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes):类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞
(RA-FLSs-exo):类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的外泌体
CIA:胶原性关节炎诱导(的小鼠模型)

 

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 第一部分:验证表型 

 
Figure1——RA-FLSS-exo对RA成骨细胞分化的抑制作用
图A:透射电镜、纳米粒子和Western blot分析了RA-FLSS-exo的形态、粒径大小和浓度,以及CD63和TSG101蛋白条带;
图B、C:荧光显微镜观察成骨细胞对RA-FLSS-exo的内吞作用;CCK8检测与RA-FLSS-exo共培养的成骨细胞活性;
图D、E、F、G:共培养后,ALP、茜素红染色、qPCR、WB检测成骨相关标志物的变化。
 
以上结果证明了: RA-FLSS-exo能够抑制成骨
Figure2——含miR-486-5P的RA-FLSS-exo对RA成骨细胞分化的影响
将敲低/过表达miR-486-5p质粒处理的RA-flss-exo与成骨细胞共培养
图A:验证敲低/过表达miR-486-5p效率;
图B:检测敲低/过表达miR-486-5p后的细胞活性;
图C、D、E、F:敲低/过表达miR-486-5p后,ALP、茜素红染色、qPCR、WB检测成骨相关标志物的变化。
 
以上结果证明了:含有miR-486-5p的外泌体(RA-FLSS-exo)能够促进成骨。

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第二部分,寻找机制
 
Figure3——找miR-486-5p的下游靶基因(3‘UTR)
图A:TargetScan预测miR-486-5p与Tob1之间的特异性结合位点;
图B:荧光素酶报告基因实验验证miR-486-5p与Tob1的靶向关系(突变3’UTR序列,常规动作);
图C、D:分别用敲低/过表达miR-486-5p的质粒和外泌体处理成骨细胞,qPCR检测miR-486-5p和Tbo1的表达情况。
 
以上结果验证了:Tbo1是miR-486-5p的靶基因,即miR-486-5p能够与Tbo1的3‘UTR结合。
Figure4—— miR-486-5P通过抑制Tob1促进成骨细胞分化(Rescue验证)
图A:构建过表达miR-486-5p+过表达Tbo1以及对照的基因工具,验证其效率;
图B:CCK8检测处理后的成骨细胞活性;
图C、D、E、F:过表达miR-486-5p+过表达Tbo1后,ALP、茜素红染色、qPCR、WB检测成骨相关标志物的变化。
 
以上结果说明了:miR-486-5p是通过抑制Tbo1起到促进成骨的作用。
Figure5—— 含有miR-486-5P的RA-FLSs-exo通过抑制Tob1和激活BMP/Smad信号通路促进成骨细胞分化
图A:qPCR检测与RA-FLSS-exo共培养的成骨细胞以及过表达/敲低miR-486-5p外泌体处理的成骨细胞中Tob1和BMP2的表达;
图B、C:WB检测与RA-FLSS-exo共培养的成骨细胞以及过表达/敲低miR-486-5p外泌体处理的成骨细胞中Tob1和BMP2的表达以及Smad1/5/8磷酸化的程度;
图D:Rescue过表达miR-486-5p+过表达Tbo1,观察BMP2的表达以及Smad1/5/8磷酸化的程度回复情况;
图E、F:Rescue过表达miR-486-5p+敲低BMP2,观察BMP2的表达以及Smad1/5/8磷酸化的程度回复情况,以及细胞活性的回复情况;
图G、H、I、J:Rescue检测表型:
过表达miR-486-5p+敲低BMP2后,ALP、茜素红染色、qPCR、WB检测成骨相关标志物的变化。
Figure6—— 携带miR-486-5p的外泌体能通过抑制Tob1来减弱胶原诱导的关节炎小鼠模型的类风湿性关节炎(RA)
(有点绕,简单点说就是在动物模型中验证miR-486-5p的作用)
图A:CIA小鼠模型的临床评分;
图B:类风湿性关节炎小鼠模型严重程度的照片;
图C、D:组织染色、Micro-CT观察分析含有miR-486-5p外泌体的体内作用;
图E、F:与对照组相比,qPCR和WB检测含有miR-486-5p的外泌体对小鼠模型中Tob1和BMP2的表达以及Smad1/5/8磷酸化程度。
 
以上数据证实了:体外数据在体内的可靠性。
 
 

Figure7—— 外泌体携带miR-486-5p调控的模式图
 

本文的主变量为miR-486-5p,机制是已经烂大街的miRNA+靶基因3‘UTR,但是,作者嵌套了细胞交互,加上外泌体包装,瞬间高大上,让文章稳稳地突破了5分的门槛,这是文章最大的亮点!
 
除此之外,还有靠上了明星通路BMP/Smad信号通路,并做了Rescue回复验证,加上表型部分的数据做的也很扎实,这些也成为文章过5分的加分点。
正在做miRNA的小伙伴不妨尝试一下,说不定包装之后,课题分分钟上了一个档次~
 
不过文章选用了原代细胞,采用了诱导的小鼠模型,这是酸菜老师曾经介绍的两个坑,工作量很大,但是对文章加分作用不是很明显,如果自己能选择的话,最好还是选择已经建系的细胞系。
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