单细胞测序-scRNA的测序基础

导语

单细胞测序(single-cell sequencing),顾名思义就是能从单个细胞中获取遗传信息的测序技术。单细胞测序技术为什么近来大火,那么它能帮科研工作者能解决哪些问题?单细胞测序技术原理和以及存在的问题有哪些?带着这些疑问,今天起跟随小编开启单细胞学习之路。

scRNA-seq 发展概述
单细胞转录组测序(single-cell RNA-seq)这项技术是由Tang et al.[1]在2009 年首次发表,但是由于测序的成本和当时有限的protocols,直到2014年scRNA-seq才得到广泛普及 [2]。近年来,随着单细胞测序技术的日渐成熟,以及以10x Genomics 为代表的生物公司将其商业化之后,这项技术也被愈来愈多的应用到生物学研究当中。今天小编给大家简单的介绍一下。

Scaling of scRNA-seq experiments; from Svensson, V. et al., [2].

scRNA-seq 优势

为什么我们要使用单细胞测序?它与传统的bulk sequencing相比具备哪些优势呢?

对于多细胞生物来说,细胞与细胞之间是有差异性的(cell heterogeneity)。这种差异性可以体现为不同的遗传背景,不同的分化状态,不同的物理特征 ,不同的基因突变谱和转录组、蛋白质组表达谱等 [3]。 这些差异可以帮助我们理解和研究不同细胞的临床生理表现。例如具有高度多样性肿瘤细胞。肿瘤在发生发展过程中,细胞持续产生新的突变而形成了许多亚细胞群,由于它们不同的免疫特性,生长速度以及转移能力等方面的差异,使得对药物或者放疗的临床反应有所不同。传统的研究中,大家往往根据细胞的物理形态或者marker genes来区分不同的细胞种类,对比之下单细胞测序则更加精确,大大的提高了细胞差异性研究的分辨率。

 

Picture taken from https://github.com/hbctraining/scRNA-seq [3].

针对转录组来说, 在传统的bulk RNA-seq 中,由于我们检测到的是是来自于多细胞的基因的平均表达, 自然就掩盖了细胞差异性的信号,特别对于一些来自罕见细胞亚群的信号就会被中和。

 

Taken from https://www.10xgenomics.com/blog/single-cell-rna-seq-an-introductory-overview-and-tools-for-getting-started [4].

而scRNA-seq的优势是它能够检测出这种差异性,提高了基因表达研究的分辨率, 因此它常被应用于以下几个方面 [5]:

1) 探索组织中存在哪些细胞类型或者亚群。

2) 识别未知或稀有的细胞类型或状态 。

3) 阐述在细胞分化过程 或者不同时间 (time-courses) 内基因表达变化。

4) 检测特定细胞亚群的差异表达;通过表达谱进行聚类,推断基因调控网络。

Common applications of single-cell RNA sequencing, from Trapnell et al., 2016 [5].

scRNA-seq 工作流程

这里小编对scRNA-seq技术简单介绍一下。当前scRNA-seq 的典型工作流程包括分离单细胞,提取RNA, 逆转录,扩增,构建文库和测序。早期的操作非常直接, 就是先将单个细胞逐个分离出来再分别进行建库,然而这种操作通量低且成本高。目前更常见的是将单个细胞包裹在微流体装置中的液滴中 (droplet-based),在那里将mRNA转换为cDNA并扩增。

 

每个小滴都带有一个独一无二的DNA “barcode”, 标记了它来自哪一个单个细胞。除此之外, 也有protocols会采用唯一的分子标识符(umi),对捕获的mRNA在扩增测序之前进行标记。一旦逆转录完成,就可以将来自许多细胞的cDNA混合在一起进行测序。

单细胞测序技术噪音

 

从流程中可以看到,实验操作还是很复杂的,这些实验技术带来的noise也使得下游的数据分析过程面临更多的挑战。在数据分析之前, 我们需要考虑一些常见的Technical noise 包括:

1) 细胞的完整性:在细胞分离和建库的过程中,可能会掺入死细胞,或者多个细胞被捕获在同一个液滴中(doublets or multiplets)。

2) 批次效应(batch effect):类似于bulk RNA-seq, 细胞在被分组处理时,外在环境差异可能导致实验数据产生批次差异。

3) 对于droplet-based scRNA-seq,并不是所有的mRNA分子都能被捕获到, 并且由于测序深度比较浅, 一般来说每个细胞仅能检测到10~50%的转录本,这导致细胞中许多基因计数为0, 给之后分析工作增加了很大的计算负担。

小编总结

随着单细胞测序技术的不断成熟,此类数据会越来多,在高分期刊的发表也越来越常见。然而与传统的测序数据相比,单细胞数据分析则更加的复杂。之后我们会带大家了解典型的scRNA-seq 数据分析步骤,并进一步说明如何灵活的运用这些步骤。

参考资料/文献

1. Tang, Fuchou, Catalin Barbacioru, Yangzhou Wang, Ellen Nordman, Clarence Lee, Nanlan Xu, Xiaohui Wang, et al. 2009. “mRNA-Seq Whole-Transcriptome Analysis of a Single Cell.” Nat Meth 6 (5): 377–82. https://doi.org/10.1038/nmeth.1315.

2. Svensson, V., Vento-Tormo, R. & Teichmann, S. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nat Protoc 13, 599–604 (2018)

3. https://github.com/hbctraining/scRNA-seq

4. https://www.10xgenomics.com/blog/single-cell-rna-seq-an-introductory-overview-and-tools-for-getting-started

5. Liu S and Trapnell C. Single-cell transcriptome sequencing: recent advances and remaining challenges [version 1; peer review: 2 approved]. F1000Research 2016, 5(F1000 Faculty Rev):182 (https://doi.org/10.12688/f1000research.7223.1)

6. https://en.wikipedia.org/wiki/Single_cell_sequencing

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