肿瘤多区域取样的进化分析二:食管鳞状细胞癌的空间瘤内异质性和时间克隆进化

Spatial intratumoral heterogeneity and temporal clonal evolution in esophageal squamous cell carcinoma

IF:24.455

食管癌是最常见的人类癌症之一,每年导致全球超过40万人死亡。风险最高的地区在东亚,以及非洲东部和南部,最常见的类型是食管鳞状细胞癌(ESCC)。接受外科手术的ESCC患者的5年生存率低于30%,因为大部分肿瘤无法切除或在诊断前就已经转移。

背景介绍
近年来,一些大规模的基因组研究发现了ESCC基因组有数百个体细胞突变和拷贝数改变(CNAs),并已识别出显著突变的基因,包括TP53、PIK3CA和ZNF750。然而,所有这些研究中确定的基因组改变仅使用单个样本获得,而对ESCC突变的空间肿瘤内异质性(ITH,intratumoral heterogeneity)和时间克隆进化过程知之甚少。此外,虽然在ESCC中已经观察到DNA甲基化的改变,但是这些表观遗传变化的ITH的程度仍然未知,并且这种异质性是否与遗传结构相关还有待探索。

准确理解原发性ESCC肿瘤的基因组和表观基因组结构对于开发个体化患者治疗和分子生物学标志物至关重要。在本研究中,通过整合分子方法解决这些关键问题,包括多区域全外显子组测序(M-WES,multiregion whole-exome sequencing)和全局甲基化分析以及系统发育和系统表观遗传学树的构建

数据介绍

1. 中国河南省林州食管癌医院的13个患者的ESCC组织样本,包括原发性食管肿瘤和形态正常的食管上皮边缘,对13个患者的基因组DNA进行M-WES检测。

2. 引用5个工作的ESCC测序数据。

3. COSMIC数据库的癌基因数据。

结果解析
01
ESCC肿瘤内空间异质性

13个患者的基因组DNA进行M-WES检测,对每个患者测肿瘤的4个区域(共51个肿瘤区域,样本ESCC04未测4个区域),还有1个匹配的正常的食管组织样本(共13个)测序。共有1610个非沉默的体细胞突变(影响1427个基因)和鉴定出568个沉默突变,验证率为90%。

为了探索ITH和ESCC的基因组进化,在每个肿瘤区域识别的体细胞突变(包括沉默突变和非沉默突变)的基础上建立系统发育树,每棵树的主干、“共享”分支和“私有”分支分别代表在所有肿瘤区域的突变、在部分但不是全部肿瘤区域的突变和仅在一个肿瘤区域的突变(Fig. 1a)。13例ESCC均显示出空间ITH,平均35.8%的体细胞变异具有空间异质性。

对可能具有生物学相关性的影响driver基因的突变的相对时间的分析对于识别癌症基因组的进化过程以及进一步改进精准医疗策略是至关重要的。为了解决这个问题,接下来根据最近的5套大规模ESCC测序数据、COSMIC数据库的癌基因数据,确定了潜在的driver突变,然后在系统发育树中追踪这些突变。Driver突变在树干中的富集程度明显高于passenger 突变(Fig. 1b)。这说明driver突变是肿瘤进化过程中相对早期的事件,与之前在其他类型肿瘤中的发现一致。将推测的driver突变分类为致癌基因或肿瘤抑制基因(TSGs),发现有一半的映射到分支的driver突变是致癌基因,只有22.4%位于主干的driver突变影响癌致基因,其余是TSGs。这些发现强调了在考虑ESCC中这些突变的抑制时需要谨慎,因为之前的研究表明,抑制亚克隆driver会引发非突变亚群的生长加速。

02
推测的driver突变的克隆状态

接下来研究了个体区域内体细胞突变的克隆状态。通过对局部拷贝数、等位基因变异频率(VAF)和肿瘤细胞纯度的综合分析,计算每个肿瘤区域的癌细胞率(CCF)。有几个driver突变是亚克隆的,而且可能是ESCC中发生的晚期事件,如MTOR、 KEAP1、PTPRB和FAM135B突变。相比之下,主干上癌症相关基因,如TP53、NOTCH1、CREBBP、KMT2D和ZNF750等,则主要以完全克隆的方式发生突变(Fig. 2),进一步证实该工作早期的系统发育树分析的结果,表明这些突变可能是ESCC发展的早期病变。一些样本分析表明,driver突变可能具有混合和复杂的瘤内克隆状态,而目前的单采样方法可能由于克隆优势的错觉而误解这些关键的基因组病变。

进一步研究了所有非沉默的基因变异和相关的途径,可能成为治疗的目标。影响PI3K -mTOR通路的组成的突变通常是晚期事件(树枝/亚克隆)。ERBB4、 FGFR2、BRCA2、ATM 和 TP53是早期突变,可作为候选的ESCC治疗靶点。

03
拷贝数变异的瘤内异质性

根据之前的研究,确定了ESCC中涉及重要癌症相关基因的复发性CNAs,与本工作样本的复发性CNAs频率相似。一般来说,病例内的CNAs比不同病例间的更相似,发现CNAs存在广泛的ITH, 90%(9/10)的复发性CNAs在空间上是异质性的。与体细胞突变相似,CNAs也表现出显著的空间ITH,与其他几种类型癌症的观察结果一致

患者内突变率(平均每个病例有168个突变)高于区域内突变率(平均每个区域有139个突变),说明多重活检方法在基因组检查中的分辨率的提高。特别是对于分支上的癌相关基因,目前的M-WES方法明显提高了检出率的敏感性(表1)。此外,亚克隆突变在每个肿瘤区域发现的比例远远低于在每个样本中(表2)。这些结果再次表明,一个活检进行测序数据的分析可能会低估突变的发生率,特别是晚期突变。

04
突变谱和特征的时间分解

为了确定ESCC中突变过程的时间动态,本工作使用 deconstructSigs包对主干和分支上突变的突变谱进行分析,deconstructSigs识别了预先定义的特征的线性组合,该线性组合最准确地重建了单个肿瘤样本的突变谱。主干和分支突变与整体突变谱相似,显著富集在特征1替换(与年龄有关),更细微的富集在APOBEC相关的特征2和13替换(C>G and C>T substitutions in a TCW context, where W = A, G, C or T)(Fig. 3a)。接下来,计算了个体突变特征对每个肿瘤的贡献(Fig. 3b),并在检测的肿瘤中确定了几个特征,包括特征1(年龄)、特征2和13(APOBEC),以及特征6和15 (DNA错配修复),与之前食道鳞状细胞癌和其他鳞状细胞癌的结果一致。与主干突变相比,许多肿瘤的特征1在分支上的相对贡献显著下降,在某些情况下,还观察到与DNA损伤相关的特征(特征3和15)在分支上相对贡献增加(Fig. 3c,d)。解释同一肿瘤内突变谱的这些时间差异需要进一步的研究,但数据表明,在ESCC进展过程中,不同的突变过程可能在亚克隆多样化中发挥重要作用。

05
ESCC中DNA甲基化的瘤内异质性

与其他癌症一样,表观遗传异常与ESCC的发展和发病机制有关。为分析ESCC ITH在表观遗传水平及其与亚克隆基因突变的潜在关系,对3个样本(ESCC01、ESCC03和ESCC05)测甲基化水平。首先发现在同一个样本中,肿瘤区域与正常组织的CpG甲基化有差异。然后将甲基化差异探针分成共享改变(同一病例中所有肿瘤区域内一致)和私有改变(在一个或多个区域内存在,但不是全部)。使用带有私有改变的探针来推断肿瘤的进化,并基于甲基化特征之间的欧几里德两两距离为每个病例构建系统表观遗传学树。通过测定相对于无根树的Robinson-Foulds(RF)距离,对这三种病例的系统进化树和系统进化树之间的拓扑相似性进行评估(Fig. 4a)。根据最近个关于胶质瘤的研究,三个病例的RF距离(均为零)表明,这三个病例的遗传和表观遗传树拓扑结构高度一致。此外,为了减轻非肿瘤DNA污染的混杂效应,采用了两种不同的方法来解释和减轻免疫细胞(样本中主要的非癌细胞组成)的潜在影响;当使用未校正的甲基化值或使用两种校正方法得到的值时,也观察到类似的结果。这些发现说明了在ESCC细胞克隆进化过程中基因组和表观基因组改变之间可能存在的关系,并提示了多种表观遗传学上不同的亚克隆细胞群的存在,正如最近在前列腺癌、神经胶质瘤和肝细胞癌中的相关研究结果。

一些TSGs在同一病例中的部分肿瘤区域发生的启动子发生高甲基化,说明其在不同肿瘤区域的表达可能受到不同程度的抑制。还有一些TSGs发生了突变并获得启动子高甲基化,说明一些基因在基因组和表观基因组的进化过程中都受到了早期的破坏。

为了探索ITH与ESCC中DNA甲基化的潜在生物学相关性,将CpG探针分为两组,一组是肿瘤中甲基化水平高于邻近正常组织(高甲基化),另一组是甲基化水平低于正常组织(低甲基化)。共享探针在不同肿瘤区域的变化相对一致,而其余的(私有)探针在肿瘤区域之间表现出明显的差异(Fig. 4b),反映了在系统表观遗传学树中广泛的ITH。接下来,将享探针和私有探针根据各种相关的功能基因组类别分类,比较它们在CpG岛(CGIs)、CGI shores、启动子和增强子等,将每个类别中探针频率与芯片所有探针确定的背景频率进行比较(Fig. 4c)。CpG位点显示了几种常见的癌症类型的甲基化模式。私有CpG位点的分布在很大程度上与共享的CpG位点相似(Fig. 4c),说明肿瘤内甲基化异质性可能在ESCC肿瘤的亚克隆多样化中发挥作用。对启动子中带有私有高甲基化探针的基因进行GO富集了分析,发现这些基因在癌症相关的过程中显著富集,包括细胞增殖、分化、迁移、粘附和转录调控(Fig. 4d)。进一步表明DNA甲基化的异质性可能参与了ESCC细胞的进化生物学。

小编总结
本工作对13例ESCC样本组织的不同位置进行多区域全外显子组测序分析和全局甲基化分析,构建了系统发育和系统表观遗传学树,发现ESCC的瘤内具有空间上的异质性,识别了肿瘤早期和晚期的突变基因,发现拷贝数和甲基化都具有瘤内异质性。
引用:

Hao JJ, Lin DC, Dinh HQ, et al. Spatial intratumoral heterogeneity and temporal clonal evolution in esophageal squamous cell carcinoma. Nat Genet. 2016;48(12):1500–1507. doi:10.1038/ng.3683

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