肿瘤多区域取样的进化分析三:食管鳞癌及其前体细胞病变的基因组比较

Genomic comparison of esophageal squamous cell carcinoma and its precursor lesions by multi-region whole-exome sequencing

Nat Commun. 2017 Sep 12; doi: 10.1038/s41467-017-00650-0

食管癌是第8大常见癌症,第6大致命癌症,5年生存率低至15%~25%。食管鳞状细胞癌(ESCC)是食管癌的主要亚型,占全世界食管癌病例的90%,其发病机制、危险因素和基因组结构都与EAC不同。今天我们继续分享关于ECSS的多区域取样分析。

背景介绍
ESCC的发病机制是一个多步骤的过程。鳞状上皮细胞核出现异型,细胞异常成熟。这个阶段为异型增生,是ESCC的前体病变。目前仍然不清楚从鳞状异型增生到ESCC的演变过程,特别是关键的致癌事件是如何发生以及在哪个阶段发生的。

对同一患者的前体病变和肿瘤区域进行采样,是研究肿瘤演变过程的一种实用方法。研究食管腺癌(EAC)肿瘤演变也应用了类似方法。

数据介绍
样本取自中山大学肿瘤中心肿瘤资源库。45例ESCC患者(TD),13例异型增生患者(NTD),所有患者术前均未接受任何治疗。从TD中的25例获得了配对的异型增生和肿瘤样本。共157个样本,包括62个肿瘤(59个ESCCs和3个淋巴结转移)样本,44个低分级异型增生(LD)样本,31个高分级异型增生(HD)样本,7个正常上皮样本,13个NTD样本 。所有样本的平均测序深度为83X。

结果解析
01
鳞状异型增生与ESCC突变负担相似

对于所有ESCCs,总突变数53~507,非沉默突变中值为80(2.9突变/Mb),沉默突变34(1.1突变/Mb),与之前的研究结果相似(Fig. 1b:所有NTDs、LDs、HDs 和ESCCs与其他几种癌症的突变密度比较)。

在突变背景下鳞状异型增生和ESCC样本中,C>T转换是显著富集的,特别是在CpG二核苷酸上(Fig. 1c,d),说明胞嘧啶的自发脱氨作用是肿瘤发生过程中突变积累的主要原因。

 

02
鳞状异型增生与ESCC的突变谱

为了观察整体突变情况,比较所有样本中ESCC相关驱动基因的突变频率。一般情况下,大部分驱动基因也出现在高突变频率的异型增生样本中(Fig.2)。TP53突变在异型增生样本中频率很高(95.6%),甚至在NTDs中也发现了一些突变 (30.8%;Fig. 2),提示TP53突变可能在ESCC进展的早期发生。

 

03
鳞状异型增生与ESCC存在明显的异质性

TD中多(≥3)个样本的患者的异型增生样本和ESCCs突变的区域分布 (Fig. 3a,c,e)。构建系统发育树来描述克隆关系和排序事件(Fig. 3b,d,f)。

Fig. 3:典型病例的体细胞突变和系统发育树的区域分布。a-f:热图显示每个病例中所有突变在不同样本之间的区域分布。突变类别与系统进化树线条的颜色对应。树干和树枝的长度与突变数量成正比。热图中存在一些与系统发育树不匹配的突变。g-i:箱形图展示在每种情况下成对样本的异质性指数(HI)、欧几里德距离和交叉突变的密度(以负值表示)。

04
拷贝数改变发生于ESCC早期

低深度全基因组测序评估33异型增生样本和33 ESCCs的拷贝数状态,显示广泛的CNAs(Fig. 4a),拷贝数模式高度相似。NTD的异型增生样本中有8例存在大量CNAs(Fig. 4c),CNAs发生在ESCC发展的相对早期阶段。此外,3q和5p上的CNA增加以及3p上的CNA缺失在其他癌症中普遍存在,突出了它们在鳞状细胞癌发生发展中的重要作用。3q的扩增可能出现在恶性转化的初期。

无论在异型增生样本还是在ESCCs中,SOX2、PIK3CA、MYC、CCND1和FGFR1基因上扩增的发生率都很高(Fig. 5a)。基因组倍增在TD中普遍存在,但在NTD中不存在(Fig. 5b)。

来自同一患者的所有样本中,CNAs的异质性程度与突变的异质性程度基本一致。然而,在TD中几个病例的突变分布不同,但拷贝数模式高度一致,表明在这些患者中,CNAs不仅出现较早,而且在ESCC进展过程中也保持稳定

05
TP53突变协同LOH对肿瘤恶变影响

对于每一个ESCC相关的驱动突变,评估TD组的病人中每个驱动基因作为一个树干突变的比例,发现只有TP53对主干有显著的偏向 (Fig. 6a;Fisher’s exact test,P<0.001)。有36病例的所有样本都至少有一个TP53突变。此外,13个NTDs中有4个TP53基因突变(Fig. 2)。推断TP53突变出现在ESCC早期,大多数突变发生在p53蛋白的DNA结合区域(Fig. 6b)。

TD和NTD中异型增生样本之间,TP53杂合性的损失(LOH)存在显著差异(Fig. 6c)。在TD的71个异型增生样本中有69个存在TP53突变协同LOH 。

 

小编总结

在本研究中,通过将WES应用于同一患者的不同阶段(从异型增生到ESCC)的多个样本,最先展示ESCC前体病变的基因组改变,并描述了ESCC发展中的克隆进化。发现异型增生与肿瘤之间存在明显的异质性,TP53的突变和3q的拷贝数增加是ESCC发展的早期改变。

用到的算法和方法

1. BWA(默认参数)比对测序序列与参考基因组hg19(UCSC),生成BAM

2. Samtools对BAM文件进行排序和合并

3. Picard工具标记和删除副本

4. 基因组分析工具包(GATK2.1-8)对所有插入和缺失重新比对并质量校正

5. GATK Unified Genotyper召回SNVs和INDELs

6. 联合调用方法MultiSNV召回SNV,需手动检查以确保真实准确

7. SNPEFF 3.0对所有变异进行注释

8.MEGA 最大简约算法推断每个患者样本间的亲缘关系

9.两个R包

(1)DNAcopy采用CBS算法分割拷贝数数据,识别拷贝数异常的基因组区域

(2)Sequenza肿瘤细胞纯度计算

参考:

Chen X X , Zhong Q , Liu Y , et al. Genomic comparison of esophageal squamous cell carcinoma and its precursor lesions by multi-region whole-exome sequencing[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):524.

文献解读

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