顶级套路:三元反馈环路+磷酸化修饰

这次的《文献品谈会》由晨星计划成员“I one”老师为大家带来一篇发表在 Nature Communications 三元反馈环路的文章。
结合标题、摘要和机制图,可以推测本文的科学假设:NUAK2通过磷酸化LAT1S促进YAP/TAZ的入核转录,YAP/TAZ入核反过来又促进NUAK2的转录表达,构成一个正反馈环路。
三元反馈环路+磷酸化修饰。以NUAK2为主变量,先下后上,展开验证。下是:NUAK2通过磷酸化LATS促进YAP/TAZ入核转录;上是:YAP/TAZ通过转录调节促进NUAK2的表达。
 
1文题四要素

疾病:bladder cancer膀胱癌;
主变量分子:NUAK2;
表型:tumorigenesis;
因变量:LATS1、YAP/TAZ
2背景介绍

• 在肿瘤中,Hippo通路常处于关闭状态,促进转录共激活因子YAP/TAZ进入胞核内结合其他转录因子(如AP-1、TEAD),增加致癌基因的转录。
• LATS1可以使YAP / TAZ磷酸化,促进YAP / TAZ的胞质聚集并随后降解,从而抑制YAP/TAZ的入核参与转录,即LATS抑制YAP/TAZ入核参与转录。
3逻辑论证步骤

由于LATS1可以磷酸化并抑制YAP/TAZ入核转录是已经报道过的,所以文中这部分的论证省略了。
4结果解读

Fig1: NUAK2促进YAP/TAZ入核参与转录(通量筛选主变量NUAK2,并验证NUAK2促进YAP/TAZ核内转录的功能)
a 通量筛选出NUAK2— siRNA screen;
b 沉默NUAK2促进YAP/TAZ的胞浆聚集  —免疫荧光;
c 验证NUAK2促进YAP/TAZ的转录活性及靶基因表达 —-luciferase assay;
d 沉默NUAK2,YAP/TAZ靶基因表达降低  (NUAK2与YAP/TAZ转录活性正相关);
ef 结果同bd。
Fig2: NUAK2与LATS的结合(NUAK2依赖于LATS调控YAP/TAZ)
a 沉默NUAK2使p-YAP/TAZ增加;
b LUMIER筛选 NUAK2的互作蛋白为LATS — LUMIER筛选互作蛋白——筛未知;
c NUAK2与LATS1直接结合 — Co-IP——有结合;
def  LAST1促进YAP/TAZ的磷酸化(已知),NUAK2依赖LAST1促进 YAP/TAZ的核内聚集及靶基因表达 —回复实验(反反反)
Fig3: NUAK2磷酸化并抑制LAST1的活性(NUAK2依赖于磷酸化LAST1,调节YAP进入胞核)
ab NAUK2抑制LAST1对YAP/TAZ的磷酸化 —激酶活性检测;
c 筛选并验证NUAK2磷酸化LAST的位点—IP-质谱+磷酸化位点验证——有效应+证位点;
de NUAK2依赖于磷酸化LAST调节YAP胞浆磷酸化/入核转录 — 位点突变进行验证——有效应+证位点
Fig4: NUAK2参与调节YAP/TAZ靶基因的表达
ab  血清或LPA促进YAP/TAZ的去磷酸化入核的转录功能,并诱导靶基因及NUAK2的表达;
c-h  通过NUAK2抑制剂预处理,证明NUAK2参与LPA/血清诱导的YAP/TAZ的转录功能
Fig5: YAP / TAZ与NUAK2构成正反馈环路 (Fig4结合Fig5说明NUAK2是放大YAP/TAZ的通路效应所必须的)
a  沉默YAP/TAZ可以抑制NUAK2的表达;
b  YAP/TAZ与AP1结合在NUAK2的启动子区(ChIP-pcr);
c  YAP/TAZ通过结合转录因子促进NUAK2的转录 (阻断AP1后,NUAK2的表达降低至和AP1真正的靶基因FOSL1一样的水平 )
Fig6:NUAK2的表型(细胞、动物)—阻断NUAK2可以抑制肿瘤生长
ab  沉默NUAK2后肿瘤形成降低,增殖降低   in vitro;
c  敲除NUAK2后肿瘤缩小  in vivo;
d  敲除NUAK2的小鼠瘤组织YAP/TAZ表达减少—免疫组化;
efg  多株细胞中验证抑制NUAK2促进YAP-TAZ胞浆磷酸化;
h  多株细胞验证阻断NUAK2抑制YAP/TAZ的促转录功能
Fig7: NUAK2的临床组织验证 — NUAK2与膀胱癌的恶性程度相关
a  肌层侵袭性膀胱癌NUAK2表达增加 — 主变量的临床表达差异;
b  NUAK2与膀胱癌复发率相关;
c  YAP与膀胱癌的肌层侵袭有关 — 因变量的临床表达差异;
d  NUAK2与YAP在组织中表达呈正相关  —热图,主变量与因变量的临床相关性;
ef  从不同恶性程度膀胱癌中分离细胞株,检测NUAK2与YAP、E-cadherin — 免疫荧光;
ghi  沉默或者药物抑制NUAK2后,细胞增殖数下降
5全文总结

6寻找本文学习点

第一点:通过这篇文章,我们一起复习了酸菜老师在第三十四策环环相扣中提到三元反馈环路、以及磷酸化研究的套路, 而且作者常常在构建研究框架时就是朝着反馈环路的方向设计。此外,在三元成环的经典模式中只有一个主变量,在本文中的主变量为NUAK2承担创新,围绕NUAK2按照先下后上的原则设计实验。
第二点:三元成环中的分子类型的选择决定了工作量的变化,像miRNA、转录因子这些分子的选择都是性价比比较高的,因为miRNA、转录因子对靶基因的调节具有普遍性。本文中用的是YAP/TAZ为转录共激活因子,其下游调节基因也特别多。
第三点:从本文的研究设计套路来学习,本文是一个三元变量,分别用了三次筛选,两组回复验证,两组直接机制的验证来阐明了这个这反馈通路。以及NUAK2磷酸化LATS1的磷酸化套路:筛未知,有结合,共定位,有区域、析结构、有效应[磷酸化、证位点]。
值得注意的是:作者在本文中选择并验证LATS1作为NUAK2的直接作用蛋白,这一步十分巧妙,因为LATS1调节YAP/TAZ的作用机制已经有明确报道了,这样做省去了不少工作量。
第四点:从数据的完整程度来学习,酸菜老师说过,只要是超过十分的文章,工作量都是过饱和打击,本文也是这样的,很多数据都在补充资料中,大家可以细细品味~~
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