结直肠癌的单细胞转录组分析

今天跟大家分享的是六月份发表在Nature Genetics杂志(IF25.455)上的一篇文章Lineage-dependent gene expression programs influence the immune landscape of colorectal cancer,在这个研究中,使用了大量的平行单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据,揭示了决定CRC分子亚型的细胞成分的多样性及其之间的动态关系

谱系依赖性基因表达程序影响结直肠癌的免疫景观
 
转移性结直肠癌(CRC)的免疫治疗仅对具有高微卫星不稳定性的错配修复缺陷肿瘤有效,并表现出免疫浸润,这说明肿瘤细胞可以确定其免疫微环境。为了理解这一系列关系,本工作分析了来自23个韩国人和6个比利时人的91103个未分类的单细胞的转录组数据。癌细胞显示的转录特征回顾了正常的分化程序,以及遗传变异通过调节T细胞、肌成纤维细胞和髓细胞培养了免疫抑制微环境。细胞间网络重建支持了癌细胞特征和特定基质或免疫细胞群之间的联系。本工作对结直肠癌细胞景观和细胞间相互作用的观点为设计有效的免疫肿瘤治疗策略提供了机制信息。
 
一、CRC的全细胞景观
对来自Samsung Medical Center (SMC)的23个和来自Katholieke Universiteit Leuven的6个患者(数据命名KUL3)的91,103个 CRC单细胞进行分析(图1a–c)。为了提高细胞类型认定的准确性,在细胞类型鉴定前联合使用reference component analysis (RCA)和canonical correlation analysis (CCA)。在SMC和KUL3数据集中识别出六种主要的细胞类型(图1b-c)。与正常组织相比,明显可见骨髓细胞总体的增加和B细胞数量的减少对样本量较多的SMC数据集进行CMS分类(consensus molecular subtypes 分类反映了肿瘤及其相关的微环境,降低了免疫、上皮或间质表型的分子复杂性)成四组:CMS1、CMS2、CMS3和CMS4。由scRNA-seq测定的细胞比例偏向于肿瘤细胞低表达(1d)。bulk tissue RNA-seq 显示CMS2和CMS3 免疫细胞减少。相比SMC,观察到在KUL3数据集中纤维母细胞和髓细胞的富集,这可能是可由不同的采样过程引起的。

 1. 联合使用RCA and CCA对CRC样本识别细胞类型。
 
二、单细胞consensus molecular subtypes(CMS)特征
有人认为,人结肠癌细胞再现了正常结肠上皮的多系分化过程。可以看到,对SMC数据集中的正常上皮细胞的Subclustering analysis分析(使用Seurat中的graph-based algorithm进行初始聚类,Subclustering进行了次聚类来定义六种主要细胞类型)显示了不同的分化状态(图2a),即干细胞样/转运扩增细胞、结肠细胞和杯状细胞。在KUL3数据集中也是相似的情况,但也发现了其他亚群。Trajectory analysis(轨迹分析)进一步证明了分化途径起源于干细胞样/转运扩增细胞,并向结肠细胞或杯状细胞分支。沿正常上皮细胞分化轨迹的肿瘤上皮细胞投影显示,与分化细胞类型相比,具有正常干细胞样/转运扩增细胞群的肿瘤细胞共分离(图2b),说明了肿瘤细胞的再生/增殖潜力。为了研究肿瘤细胞分类的转录程序,接下来进行了聚类分析。大多数肿瘤细胞形成了患者特有的簇,这表明与正常细胞类型相比,每个患者的转录状态高度可变为了克服这种个体变异,并找到整合和分层肿瘤细胞的共同转录程序,使用了Monocle v.2的反向图嵌入技术,重建了一个无监督的肿瘤细胞轨迹。轨迹显示了转录层次,定义了9种分子状态(图2c),并收敛为两个离散的转录组(图2d)。
 
此外,样品沿单细胞CMS排列(图2e)显示以CMS2样肿瘤细胞为主或CMS1样和CMS3样细胞混合的患者组。CMS1样和CMS3样细胞共同表达不同水平的CMS1免疫和CMS3分泌上皮特征基因CMS1样肿瘤细胞在很多的CMS1组织中占主导地位,这表明免疫细胞活化有两种不同的模式,即由肿瘤或非肿瘤成分驱动。值得注意的是,单细胞CMS模式与解剖区域、微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变谱相关(图2e)。与CMS1-3类稳健的单细胞表现相反,发现很少有CMS4样肿瘤细胞,甚至CMS4组织(图2c,中间)。当估计细胞类型对各组织分子亚型的影响时,上皮肿瘤细胞与CMS4基因呈负相关,而基质细胞(包括成纤维细胞和内皮细胞)与CMS4基因呈最高的正相关(图2f)。值得注意的是,在CMS特征(图2e)以及其他与癌症相关的信号,如增殖、干细胞特性、缺氧和化疗耐药中,个别患者的肿瘤细胞表现出不同的瘤内异质性。总的来说,肿瘤细胞分析显示了lineage-associated 相关的致癌事件,通过肿瘤微环境和瘤内异质性调整转录特征,这说明了了功能多样化和环境适应。

 2.正常和肿瘤上皮细胞的转录组特征和异质性
 
三、 基质细胞动力学支持肿瘤生长
在基质细胞亚簇中,成纤维细胞和内皮细胞是主要的细胞类型(图3a)。此外,周细胞、血管平滑肌细胞和肠胶质细胞被鉴定为次要的基质细胞类型(图3a)。周细胞的特征是收缩基因(TAGLN、ACTA2)和RGS5共表达;血管平滑肌细胞的特征是收缩和细胞骨架基因表达(TAGLN、ACTA2、MYH11、SYNPO2、CNN1和DES);肠胶质细胞的的特征是SOX10, S100B和PLP1 基因表达(图3b)。肌成纤维细胞在CMS1和CMS4组织中最显著(图3a,c),说明不同亚型中基因表达是异质的(图3b,d)。所有肌成纤维细胞簇均高表达Wnt信号基因,如POSTN和WNT5A(图3b)。肌成纤维细胞通过广泛的组织重塑刺激肿瘤生长,并通过Wnt信号支持癌症干细胞存活。
 
内皮细胞簇的特征是ENG和PECAM1基因表达且无成纤维细胞特征(图3a,b)。将八个内皮细胞簇分为四种内皮细胞类型,包括尖端细胞和柄细胞。在肿瘤和正常样本中都发现了其中一个亚群-淋巴管内皮细胞(17,图3a,b)。血管内皮细胞簇包括尖状和柄状内皮细胞,其中大多数是 tumor-derived的(类6,8,3a,b)或正常colon-derived(类9,14,15,图3a,b)。值得注意的是,比较正常和肿瘤组织之间的尖端和柄细胞类型,可以发现肿瘤中“血管生成调节因子”过多,而在正常粘膜中“抗原处理和呈现”过多(图3e)
 
此外,还发现一个过表达生存素(由BIRC5编码)和CKS1B的高增殖细胞群,是一个独特的肿瘤来源集群(增殖内皮细胞,类23,图3b)。以往的研究认为这些基因与内皮细胞凋亡抑制和增殖相关。在结肠癌中,内皮细胞的高血管生成特性反映了新生血管的激活。此外,抗原呈递血管内皮细胞数量不足提示免疫刺激减弱(图3e)。ICAM1基因表达的下调也支持CRC中内皮成分的免疫衰减。

 3.正常黏膜和CRC组织中的基质细胞动力学
 
四、从粘膜免疫向抑制细胞免疫的转变
CRC组织中 myeloid expansion(骨髓扩张)(图1b、c)表明其在塑造肿瘤微环境中发挥积极作用。Subclustering analysis将髓细胞分为巨噬细胞和树突状细胞(图4a,b)。巨噬细胞簇包括促炎和抗炎亚群(图4a-c)。树突状细胞簇表达CD1C和FCER1A,与传统树突状细胞一致。与KUL3患者相比,在SMC患者的正常粘膜中发现了极少的髓细胞(图4a,b)在两个数据集中发现了相似的髓细胞类型(图4a,b)。肿瘤组织中的巨噬细胞呈混合表型,表达促炎和抗炎基因(图4c)。特别是与正常组织相比,渗出型焦磷酸蛋白1 (SPP1)+巨噬细胞部分在肿瘤核心和边缘富集。SPP1+巨噬细胞在CMS1型和CMS4型患者中增加(图4c),是通过TCGA的结肠腺癌(COAD)和直肠腺癌(READ)数据集验证的(图4d)。SPP1+基因表达水平越高的患者预后越差(图4d),这反映了扩张的SPP1+巨噬细胞集群在CRC中的临床影响。

 4. 肿瘤相关巨噬细胞的转录重编程
 
在正常黏膜和CRC组织中,T淋巴细胞是最大的免疫细胞簇(图1b,c)。SMC数据集中的20个T细胞亚群代表来自CD4+CD8+γδ T细胞和NK细胞的不同的T细胞亚群(图5a)。CD4+和CD8+T细胞簇都包含几个亚簇,代表从初始状态到激活或衰竭状态的过渡。许多T细胞亚型在正常组织和肿瘤组织中分布不均:Th17和Treg细胞主要存在于肿瘤组织中,而在正常黏膜中则富集γδ T细胞(图5a,b)。当评估与MSI状态相关的免疫细胞组成作为免疫检查点抑制剂阳性反应的替代标志物时,在SMC数据集中,MSI (MSI-H)样本在高Treg人群和低Th17人群中富集(图5b,c)。通过细胞毒性和耗竭评分来评估CD8+ T细胞亚群的功能状态,肿瘤组织中CD8+ T细胞的细胞毒性和耗竭评分高于正常粘膜中的(图5d)。
 
SMC数据集的B细胞簇中,发现了卵泡B细胞和浆细胞(图5e)CRC组织中,发现B/浆细胞显著减少(图1b,c,5e)以及不同抗体同型表达(图5e)。CRC中大多数光链特异性浆细胞中,可以观察到IGHA的产出减少和IGHG的表达增加,说明了免疫微环境的系统性改变。在KUL3数据集中,在肿瘤的核心和边缘观察到IGHA浆细胞的整体收缩,但在肿瘤核心的IGHG基因表达转移更为明显。

 5. 正常黏膜和CRC组织中的适应性免疫细胞分布
 
五、CMS特异性细胞相互作用网络
为了从统计学上评估细胞动力学的变化,分别在25种细胞亚型的正常相对肿瘤组织CMS组、 MSS相对MSI-H或解剖位置组进行了卡方检验(图6a)。相比之下,基质成纤维细胞、CD4+ T细胞、γδ T 细胞和IgA+浆细胞在正常黏膜中富集。CRC细胞景观在不同的CMS、MSI-H状态和解剖部位下是不同的。在CMS1肿瘤中,包括大多数MSI-H样本,Treg细胞显著富集,而肌成纤维细胞和促炎/SPP1+巨噬细胞在CMS4肿瘤中最为显著。
 
为了了解不同细胞群之间的相互作用以及它们如何共同创造结直肠肿瘤微环境,接下来基于受体配体数据库receptor–ligand database推断出了一个假定的细胞相互作用网络。在正常黏膜中,IgA+浆细胞和CD4+T细胞周围形成相互作用最强的节点,支持粘膜抗体响应的激活。CRC组织中的IgA网络减弱,但肿瘤细胞周围出现新的互作边,连接肌成纤维细胞、SPP1+巨噬细胞、CD8+ T细胞和Treg细胞。接下来,在不同CMS组织亚型下分析CRC细胞网络,适应肿瘤微环境的大体差异。在CMS1和CMS4中,top 20个预测的相互作用主要涉及非肿瘤细胞类型,如CMS1的Treg细胞或肌成纤维细胞和CMS4肿瘤的SPP1+巨噬细胞。CMS2和CMS3组织的top 20种相互作用均预测发生在肿瘤和非肿瘤细胞类型之间,表明肿瘤细胞在塑造肿瘤微环境中起主导作用。
 
在特异性 receptor–ligand配对的分子重构中,估计了CMS4肿瘤中显著的SPP1-CD44和TGFB1-TGFBR相互作用(图6b),说明这些分子相互作用在创建免疫抑制和促转移肿瘤微环境中至关重要。总的来说,本工作的全面的细胞景观和相互作用网络揭示了CRC的分子特征,由lineage-associated的遗传改变以及基质和免疫中肿瘤驱动或旁观者的改变(图6c)。

图6. 组织CMS分类下CRC中细胞互作网络的特异重组
 
总结:
本工作使用了大量的平行单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据,揭示了决定CRC分子亚型的细胞成分的多样性及其之间的动态关系。对样本进行CMS分类,分析总样本以及各自分类中细胞的关系,研究了样本的分化途径和转录程序,同时发现单细胞CMS模式与解剖区域、微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变谱相关。基质细胞动力学研究发现,肌成纤维细胞通过广泛的组织重塑刺激肿瘤生长。随后分析了正常黏膜和CRC组织中免疫细胞的分布差异。最后重建了细胞间互作网络,研究了癌细胞特征和特定基质或免疫细胞群之间的联系。
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