【课题套路】组蛋白甲基化课题新套路

大家好,我是想课题思路想到裂开的无花果。
前几天国自然基金委公布生命科学部会评专家名单,预计九月,医学部的会评也将落下帷幕。
明年的基金申请即将开始,你准备好了吗?是否已经选定课题方向?
现如今,表观遗传学在疾病研究中的地位越来越重要,高分论文中不乏DNA/RNA/蛋白的甲基化/乙酰化研究。我们公众号已经陆续解读过研究热点m6A的课题设计思路(后续还会有关于m6A的各种技术帖哒),这一回让我们来看看组蛋白甲基化修饰研究应该如何设计。
这篇今年3月发表于Nature Communications,题为“Histone methyltransferase DOT1L cordinates AR and MYC stability in prostate cancer”的研究论文就重点关注了组蛋白甲基转移酶DOT1L前列腺癌中通过泛素连接酶调控雄激素受体AR和转录因子MYC的机制。

这篇文章乍一看是一个符合我们通常套路的研究,没有什么新意,然而仔细一读,就会发现整个研究过程虽然每一步都在这条路上,但最终呈现的结果却是一个比较新的调控机制。
首先,让我们先按经典的思路来分析一下这篇文章。
 
立项依据:
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤,致死率仅次于肺癌。目前晚期前列腺癌的主要治疗方法包括靶向雄激素受体AR的治疗。尽管大部分的患者起初能够响应治疗,许多患者会发展为去势抵抗的前列腺癌(CRPC),影响治疗效果。其主要原因在于AR的持续信号转导,新一代AR靶向药物恩扎鲁胺(ENZA)的耐药性产生的原因之一就是AR通路的持续激活
DOT1L是H3K79(组蛋白3第79位赖氨酸)甲基化酶,与转录激活、延伸、DNA修复等密切相关。以往研究发现DOT1L在急性髓系白血病的发病机制中起重要作用,以及在实体瘤中抑制DOT1L具有疗效,然而,DOT1L对前列腺癌的作用尚不明确。
本研究通过探索DOT1L在前列腺癌中的作用机制,开发针对前列腺癌的新型治疗靶点,具有潜在的临床应用价值。
为了探索DOT1L促进前列腺癌耐药性的分子机制,作者进行了以下预实验
1. 用前列腺癌数据库和患者样本分析DOT1L与前列腺癌预后的相关性
作者选取了4个前列腺癌数据集(Grasso,Yu,Gulzar,Taylor)分析DOT1L表达量,并用4个数据集(Luca CancerMap prostate cancer,TCGA prostate cancer,Ross-Adams Discovery,TCGA Gleason)分析DOT1L表达量与患者预后的关系,发现DOT1L高表达与前列腺癌较差的预后相关。对患者肿瘤组织样本进行免疫组化检测H3K79me2,证实前列腺癌组织H3K79me2甲基化程度高

2. 对前列腺癌细胞系使用DOT1L抑制剂(EPZ)观察细胞表型以及AR表达情况
克隆形成实验细胞活性检测验证DOT1L抑制剂能有效抑制前列腺癌细胞生长和活力,AR阳性CRPC细胞(C42B),AR过表达细胞(22Rv1)以及ENZA耐药细胞对DOT1L抑制剂敏感。 

 
EPZ长时间处理后,AR转录水平不变,蛋白水平显著降低。

ChIPseq、RT-qPCR检测EPZ处理后AR下游基因表达,发现部分下调,但部分显著上调,与AR被抑制矛盾。(这就表明可能有另一个转录因子同时调控AR下游基因)

 
3. GSEA分析、AR靶基因预测、抑制MYC差异基因分析确定DOTL1同时调控MYC与AR
为了寻找DOTL1靶向的通路,作者首先对EPZ处理的LNCaP和PC3细胞中的转录因子进行GSEA分析,发现MYC通路显著变化,MYC靶基因在EPZ处理下被抑制。随后将MYC抑制细胞/AR靶向的显著差异基因进行比对,发现两者重合率高。WB显示仅EPZ处理的LNCaP细胞MYC表达量显著降低(这些表明MYC通过AR依赖的机制受到DOTL1调控) 

 
4. EPZ处理后差异基因表达分析和对候选基因表达量分析找到EPZ调控的E3泛素连接酶
作者推测EPZ介导的AR/MYC受到抑制是由于两者蛋白稳定性下降造成,因此通过差异基因表达分析寻找候选的E3泛素连接酶。检测EPZ处理的前列腺癌细胞中候选基因的表达量,并敲减候选基因,检测AR和MYC蛋白水平,最终确定E3泛素连接酶HECTD4MYCBP2

 
5. AR激动剂(DHT)/抑制剂(ENZ)处理发现AR调控MYCBP2
为了进一步阐明调控机制,作者用AR的激动剂/抑制剂分别处理前列腺癌细胞并检测候选泛素连接酶的表达量,发现MYCBP2显著上调/下调。

 
于是最终确定的分子有:DOTL1、AR、MYC、HECTD4和MYCBP2。
基于以上结果,可以提出假说:组蛋白甲基转移酶DOT1L通过泛素连接酶HECTD4、MYCBP2降低AR、MYC的蛋白稳定性,从而抑制AR、MYC下游基因的转录。而MYCBP2又受到AR转录调控,形成反馈机制。差不多是这样的:
接下来进行体内外实验验证这个机制,再用分子实验验证一下几个蛋白之间的调控关系就完事儿了,一切看似是个包含老套路的新文章诞生。
你以为作者就会按照这个套路做下去?然而并没有。

作者认为,这样的机制没有说服力,不能代表这一调控的真实过程。(可能作者也做了AR与MYCBP2的ChIP实验,但结果是阴性)
因此,作者又检测了MYC敲减细胞在AR抑制剂处理下HECTD4和MYCBP2的表达量,发现两者无论是否有AR抑制剂表达量都显著上升。(这就提示MYC可能直接负调控HECTD4和MYCBP2!)

 
按往常的思路,只要验证MYC与HECTD4和MYCBP2的调控关系就能形成完美的反馈调节机制。
于是作者首先分析了一下临床数据中DOTL1、MYC和HECTD4、MYCBP2表达的相关性,结果悲剧了……如下图所示,MYC的表达量和HECTD4、MYCBP2并没有很强的相关性。

难道这一切只是假象?赶紧来个ChIP-seq数据压压惊。分析一通,发现MYC确实结合HECTD4和MYCBP2的启动子。RT-qPCR验证,结果也一样。

那么问题来了,为什么临床数据和实验结果不符?(反正是我我得抓狂)
作者想到了一个点:是不是和DOT1L只在肿瘤细胞中特异调控MYC这条通路有关?是否AR和DOT1L共调控MYC?(这一点都能想到反正我是服的)
于是作者开始了一系列验证操作:
1. H3K79me2 ChIP-seq验证仅LNCaP细胞中,MYC DNA的基因下游Enhancer区(增强子)H3K79me2甲基化富集,EPZ处理后富集消失。在AR的ChIP-seq结果中也发现MYC的Enhancer区。

2. PDX(患者来源的异种移植瘤)模型的ChIP-qPCR显示AR结合和H3K79me2位点。

3. 使用AR激动剂/抑制剂的ChIP结果显示,结合AR以及H3K79me2的MYC显著上升/降低。

 
4. 使用EPZ处理后,MYC Enhancer上的DOT1L、AR结合及H3K79me2甲基化均消失。

 
5. 细胞挽救实验证明EPZ处理后回转AR,能回复MYC Enhancer上AR、DOT1L、H3K79me2的结合,也包括H3K4me2、H3K27AC等。

 
6. EPZ处理后过表达AR,MYC mRNA表达水平回复,LNCaP细胞对EPZ的耐药性增强

 
7. 用CRISPR/Cas9技术敲除MYC上AR结合的DNA区域,仅LNCaP细胞中细胞增殖受到抑制,MYC mRNA表达下降。 

 
其他的体内外验证都比较常规,有兴趣可以阅读原文和补充材料,附上链接:https://doi.org/10.1038/s41467-020-18013-7
最终,作者提出了以下机制:
前列腺癌细胞中,DOT1L和AR共同结合在MYC基因下游的enhancer区上调MYC的表达。MYC对泛素连接酶HECTD4和MYCBP2有负调控作用,泛素连接酶表达量下降,AR和MYC持续高表达。
当EPZ处理时,其与DOT1L结合,AR无法结合MYC的enhancer区上调MYC表达,HECTD4和MYCBP2表达升高,降解MYC和AR蛋白,进一步抑制AR和MYC基因的表达。(见下图)

 
总结
不得不说,这篇文章的开始是一个套路,但由于实验结果总是与预期有出入,迫使作者进行进一步的思考和不断推翻假设,又立起新的假设。与其说是一个新套路,不如说这是一个实验结果为导向的步步推论。功夫不负有心人,结合多个ChIP数据和体外验证,作者确定了最终的调控机制。
这就告诉我们,往往理想很丰满,现实很骨感。想象的和真实的机制可能相去甚远。但这篇研究论文也同时提醒我们,对实验结果的仔细分析和质疑、推论常常是科学研究的关键。希望大家都能像作者一样越挫越勇,从一堆看似矛盾、不理想的实验数据中找到隐藏的真相。
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