三阴乳腺癌BRCA1甲基化和突变景观

今天小编要和大家分享的是一篇今年七月发表在Nature Communications(IF:12)杂志上一篇关于三阴性乳腺癌中BRCA1分子分析的文章,文章以BRCA1为切入点对BRCA1高甲基化和BRCA1突变三阴性乳腺癌的遗传、表观遗传、转录组和免疫浸润表型等进行了全面分子比较,这种对疾病关键基因进行分析的文章我们可以学习借鉴
BRCA1甲基化和BRCA1突变三阴性乳腺癌的全面分子比较
 
一.首先介绍下文章的研究背景
三阴性乳腺癌(TNBCs)约占所有乳腺癌10%,临床上具有侵袭性,并且预后通常较差,缺乏针对性的治疗方法。TNBC肿瘤表现出高度的分子异质性,BRCA1乳腺癌易感基因中的致病性变异有关,有7% -20%的确诊患者具有致病性胚系或体细胞变异,并且由关键通路基因的遗传或表观遗传改变引起的同源重组缺失(HRD)是BRCA缺陷乳腺癌的一个决定性特征。因此,今天向大家介绍的文章利用全基因组和RNA测序数据,研究了237例三阴性乳腺癌(TNBCs)的BRCA1启动子甲基化频率遗传、表观遗传、转录组和免疫浸润表型进行了全面的分析。
 
二.文章主要的研究方法 
1) 患者队列:研究分析了237例TNBC队列,通过焦磷酸测序识别57例BRCA1甲基化病例,通过WGS识别25例BRCA1-null病例。所有病例均有完整的WGS、RNA测序、全局DNA甲基化谱和广泛的临床随访数据
 
2) BRCA1启动子甲基化分析作者从之前的研究中获得BRCA1焦磷酸测序启动子甲基化状态。
 
3) 全局表观遗传分析:研究使用Illumina Infinium MethylationEPIC 微珠芯片BRCA1甲基化和BRCA1-null病例进行了整体表观遗传学分析。输入DNA与WGS相同,从保存在RNAlater中的肿瘤组织中提取的。
 
4) 基因表达分析:作者使用RNA-seq数据进行基因表达分析,进行了监督和非监督分析同时,根据PAM50、IntClust10、CIT报道的TNBC亚型(TNBCtype)进行分子亚型分类为了增加基因表达分析中BRCA1-null肿瘤的数量以获得更大的统计效力,作者27个ER-和PR-阴性BRCA1病例中生成了新的RNA测序数据作者还使用xCell和CIBERSORTx对RNAseq数据进行免疫细胞去卷积分析。
 
5) 全基因组序列分析作者获得了BRCA1甲基化和BRCA1-null病例的全基因组测序数据,包括突变calls、突变和重排特征、拷贝数谱和HRD分类。84%的BRCA1-null病例和82.5%的BRCA1甲基化病例在30倍靶深度下进行了测序,而其余病例在15倍靶深度下进行了测序。
 
6) PD-L1免疫组化和TILs作者使用SP-142抗体(Roche)在组织芯片上53个甲基化的BRCA1和25个BRCA1-null的肿瘤进行PD-L1免疫组化。由经认证的乳腺癌病理学家进行TILs评分,并按每个样本的百分比进行汇总根据国际乳腺癌免疫肿瘤生物标志物工作小组的国际共识评分建议进行评分
 
7) 新抗原预测:作者利用NeoPredPipe预测假设的新抗原,并进行HLA分型
 
8) 生存分析:作者使用K-M曲线及log-rank检验及多因素cox回归分析等方法对样本进行生存分析。
 
三.研究的结果及主要内容
1. TNBCBRCA1突变与启动子甲基化
在文章的第一部分,作者首先对237例TNBC患者的BRCA1突变与启动子甲基化进行了分析,表1展示了患者的临床特征,而研究的整体流程如图1所示。可以观察到在这些患者中,有24.1%根据焦磷酸测序归类为BRCA1启动子甲基化的患者,25例为BRCA1-null病例,其中19例携带胚系变异,6例体细胞变异。接着作者对与BRCA1基因相关的CpGs的Illumina DNA谱系数据进行分析来验证焦磷酸测序分类结果(图2a)同时,与之前的报道结果相似,高甲基化病例的RNA测序显示BRCA1 mRNA表达明显降低2b此外,进一步研究发现不具有BRCA1 LOH的BRCA1高甲基化和BRCA1胚系突变病例的重排特征和缺失比例相似,具有微同源性,代表BRCA1缺陷癌的典型特征2c作者也观察到在高甲基化病例中,肿瘤细胞含量与BRCA1 CpG等位基因甲基化率呈很强的线性相关(图2d)结合上述结果可以发现肿瘤具有替代特征3、重排特征2和3以及BRCA1基因表达缺失的基因组模式,并且这些都是BRCA1缺失肿瘤的特征,而不是BRCA2缺失肿瘤的特征(2e)。总结在文章的第一部分作者对样本信息进行了介绍,描述了研究的流程,并对BRCA1突变与启动子高甲基化情况进行了基本的刻画)。

1 患者的临床特征
 

 图1 研究的整体流程

 

2 BRCA1高甲基化、基因表达和HRD关联
 
2. 外周血BRCA1启动子高甲基化水平升高
在使用测序数据对样本BRCA1的甲基化水平及基因表达进行分析之后,在文章的第二部分作者研究了外周血中的BRCA1。由于家族史或诊断时年龄太小,这237例患者中有46例接受了临床BRCA1/2胚系筛查。对这些患者进一步研究作者发现BRCA1高甲基化患者在诊断时明显更年轻,高甲基化患者的诊断年龄与胚系BRCA1变异患者相似3a此外BRCA1高甲基化患者的外周血DNA中BRCA1启动子甲基化水平也高于未甲基化肿瘤和无BRCA1/2变异的患者3b)。为了证实这些发现,作者进一步分析了其他病例的外周血DNA结果发现,当结合临床筛查和未筛查的患者时,观察到较高的BRCA1血液DNA甲基化水平似乎与年龄无关3c)。(总结这部分作者对样本外周血进行分析,研究了甲基化与年龄等因素的关系)。

3 外周血BRCA1甲基化、基因表达亚型和治疗后的预后
 
3. BRCA1甲基化TNBC的临床和基因组特征
在这一部分作者对BRCA1甲基化TNBC的临床和基因组特征进行了研究,表2展示了根据临床病理变量和分子亚型定义的TNBC患者中BRCA1启动子高甲基化和BRCA1-null频率。在整个研究队列中,可以观察到遗传性BRCA1病例诊断年龄较低的趋势,其次是BRCA1高甲基化病例、BRCA1/BRCA2体细胞病例无改变病例3d)。此外,目前已经提出了几种基于基因表达的乳腺癌亚型(如PAM50、CIT及TNBC特异性亚型),结合分析作者发现BRCA1高甲基化都与 basal-like表型密切相关(表2和图3e)。总结这部分内容主要是对BRCA1突变与启动子高甲基化样本的临床与基因组特征针对不同亚型进行分析)。

 表2 在TNBCBRCA1启动子高甲基化和BRCA1-null的频率

 
4. BRCA1高甲基化与TNBC患者预后
在这一部分作者研究了BRCA1启动子高甲基化状态与辅助化疗后疗效的关系,在经过单因素Cox回归,多因素Cox回归分析及Kaplan Meier分析后,可以发现单独或联合BRCA1高甲基化的患者与BRCA1-null的TNBC患者相比,IDFS明显延长(图3f,图3g)。(总结这部分作者结合单因素Cox,多因素Cox及K-M曲线及log-rank检验等方法分析了BRCA1高甲基化与TNBC患者预后的关系)。
 
5. BRCA1甲基化和BRCA1-null的TNBC遗传表型
在这一部分,作者为了验证BRCA1高甲基化与BRCA1-null肿瘤具有相似的遗传和基因组肿瘤表型的假设,比较了两个不同队列的两组WGS数据,结果发现两组的拷贝数扩增缺失的全基因组图谱高度相似(图4a)观察到,在拷贝数扩增(图4b)和突变(图4c)方面,两组之间存在一些小的频率差异。当对深度测序数据进行分析时观察到两组样本在替换、插入及重排上存在差异(图4d)。接着作者又对突变特征进行了分析如图4e所示,发现一些重排特征没有显著差异(图4f),替代和重排特征的层次聚类和主成分分析,或HRDetect成分,没有将高甲基化从BRCA1-null病例中分离出来(图4g i),DNA修复影响类似总结这部分作者对两个队列的两组WGS数据进行分析,验证BRCA1高甲基化与BRCA1-null肿瘤具有相似的遗传和基因组肿瘤表型)。

4 BRCA1甲基化和BRCA1-null的TNBC遗传表型
 
6. BRCA1甲基化及BRCA1-null TNBC中的DNA甲基化
在这一部分作者对25例BRCA1缺失和57例高甲基化病例的Illumina甲基化谱进行了比较经过预处理和过滤后,留下614977个CpGs组间的监督差异甲基化分析确定了32个显著的CpGs基于32个CpGs的聚类分析显示,在235个DNA甲基化病例的整个队列中,BRCA1高甲基化与非甲基化肿瘤被很好的划分开(图5a)。总结这一部分作者对两个队列的甲基化谱进行了比较研究BRCA1-nullBRCA1高甲基化病例的甲基化差异)。

5 BRCA1高甲基化和BRCA-null TNBC的DNA甲基化和转录特征
 
7. 基因在BRCA1甲基化和BRCA1-null TNBC中的表达
在这一部分作者将研究目光落在了BRCA1-nullBRCA1高甲基化病例的转录组差异上,在对7224个高变异基因进行无监督聚类后并没有在两组样本观察到特异的亚群(图5b),作者接着对相同基因集使用不同的无监督的一致性聚类方法得到了相似的结果(图5c)此外,主成分分析显示,BRCA1高甲基化/BRCA1缺失状态、队列或PAM50亚型对解释这些肿瘤中基因表达的变异没有显著贡献(图5 d)。总结这一部分作者结合多种分析方法对转录组数据进行分析,研究BRCA1-nullBRCA1高甲基化病例的转录组差异)。
 
8. BRCA1甲基化和BRCA1-null TNBC的免疫浸润
在文章的最后一部分作者研究了BRCA1甲基化和BRCA1-null TNBC的免疫浸润,作者使用多种或者基于基因表达或者基于甲基化的去卷积方法计算BRCA1高甲基化与BRCA1-null患者的免疫细胞组成,在这些方法结果中未观察到两组样本的细胞类型比例具有显著差异。接下来作者研究了BRCA1-nullBRCA1高甲基化两类样本的PD-L1免疫组化得分,结果发现在PD-L1类别上没有显著差异,但是观察到BRCA1-null有得分更高的趋势(图6a)接着作者评估了TILs,发现也不具有显著差异(图6b)。接着作者为了研究PD-L1差异是否与新抗原负荷相关作者对新抗原数目进行了评估,结果发现,PD-L1阳性病例新抗原数目更高,但是BRCA1甲基化和BRCA1-null两组之间在总体上没有统计学差异(图6c,d)。(总结在文章的最后一部分,作者采用多种去卷积方法分析样本免疫细胞组成,并研究了两组样本间PD-L1免疫组化得分TILs、新抗原的差异)。

 图6 BRCA1甲基化和BRCA1-null TNBC的免疫浸润表型
 
到这里这篇文章的主要内容介绍完了,文章将TNBC的研究目光放在了BRCA1上,以其为切入点,对BRCA1高甲基化和BRCA1突变三阴性乳腺癌的进行了全面的分子比较,结合WGS、RNA测序、全局DNA甲基化谱和临床随访数据采用多种生物信息分析方法对三阴性乳腺癌的BRCA1启动子甲基化频率遗传、表观遗传、转录组免疫浸润表型和预后进行了全面的分析。文章研究全面结果丰富,这种针对一个疾病关键基因的多角度分析非常值得我们学习。
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