软组织肉瘤免疫相关基因综合生信分析文章思路

今天小编解读的这篇文章是2020年发表在Journal of Translational Medicine(IF:4.124)杂志上,题目为Comprehensive profling of immune-related genes in soft tissue sarcoma patients. 本文从肉瘤患者数据中构建了四个基于IRG的簇和两个基于IRG的特征。簇显示与TME,免疫检查点和免疫细胞的显著关联。此外,还建立了两个TF-IRG调控网络,用以探索IRG在肉瘤中的作用。

摘要

背景:免疫相关基因(IRG)已被确认在肿瘤发生和肿瘤微环境形成中具有重要作用。然而,缺乏对软组织肉瘤(STS)患者中IRG及其临床意义的系统分析。

方法:来自TCGA和GTEx数据库的基因表达数据用于选择差异表达的基因(DEG)。通过匹配DEG和ImmPort基因集来确定差异表达的免疫相关基因(DEIRGs),并通过功能富集分析对其进行评估。进行了确定的DEIRG的无监督聚类,并同时分析了与预后,肿瘤微环境(TME),免疫检查点和免疫细胞的相关性。建立了两个预后标记,一个用于整体生存(OS),一个用于无进展生存(PFS),并在独立的组中进行了验证。最后,构建了两个转录因子(TF)-IRG调控网络,并验证了关键的调控轴。

结果:总共确定了364个DEIRG和四个簇。发现OS,TME得分,五个免疫检查点和12种类型的免疫细胞在四个簇之间显著不同。包含20个DEIRG的两个预后标志显示出良好的区分度,并已成功验证。生成了两个结合特征和临床变量的列线图。OS和PFS特征的C指数分别为0.879和0.825。最后,建立了TF-IRG调节网络,并在三个独立的数据集中验证了MYH11-ADM调节轴。

结论:对软组织肉瘤中IRG景观的全面分析揭示了与致癌作用和免疫微环境有关的新型IRG。这些发现对预后和治疗反应具有影响,它们揭示了新的潜在预后生物标志物,并为免疫疗法提供了潜在的新靶标。
流程图

 

 

结果简述

1.    患者特征

在259个STS肿瘤样品以及911个正常样本中总共筛选出5610个DEG(下图a)。接下来,通过将IRG与DEG匹配来选择364个DEIRG,包括232个上调的基因和132个下调的基因(下图b)。为了更好地了解这些DEIRG如何驱动STS的发展,进行了GO和KEGG富集分析。功能注释表明DEIRGs主要参与白细胞迁移,调节免疫应答的细胞表面受体信号通路和激活免疫应答的细胞表面受体信号通路(下图c)。KEGG分析发现DEIRG主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用,病毒感染和T17细胞分化有关(下图d)。富集分析表明,DEIRGs不仅在肿瘤发生中起着至关重要的作用,而且在肿瘤免疫微环境中也很重要。

 

2.    基于IRG的簇与免疫功能显著相关

如DEIRG分析所示,在STS患者中,DEIRG具有明显异质性。为了深入了解STS的分子异质性并探讨IRG是否在STS中呈现出可识别的模式,作者基于364个DEIRG对所有样本进行了无监督聚类分析。确定了最佳簇数(K = 4)(下图a)。根据一致性矩阵热图,确定了四个基于IRG的簇(下图a):C1(n = 50,19.3%),C2(n = 100,38.6%),C3(n = 42,16.2%) )和C4(n = 67,25.9%)。生存分析表明C3与OS预后较差有关(下图b),但在四个聚类中PFS没有显著差异(下图c)。

基于富集分析中显示的DEIRG在免疫调节中的潜在功能,作者进一步研究了基于IRG的簇是否显示不同的免疫模式。Te Kruskal–Wallis检验表明,TME评分(包括免疫评分和基质评分)与IRG簇显著相关(如下图d)。此外,包括PD-1,PD-L1,BTLA-4,CTLA4和LAG3在内的免疫检查点的分布也不是随机的(下图e)。例如,C3免疫检查点含量更高,并且在四个簇中的免疫评分最低,并且可能对免疫疗法更不敏感。为了评估IRG与其他免疫浸润特征之间的相关性,作者比较了四个簇中22种免疫细胞的水平(下图f)。
 

3.DEIRG在STS中的预后价值

用于肿瘤的早期诊断和潜在治疗靶标的鲁棒性标志物的检测仍然是临床实践中的关键问题。最近的研究表明,IRG的异常表达发生在早期肿瘤中,并且可以在几种癌症中用作预后的生物标志物。因此,作者进一步研究了DEIRG在STS患者中的潜在预后价值。多元Cox分析是进行了18次DEIRG的构建预后标志,包括9个DEIRG的OS特征,7个DEIRG的PFS特征,其中有两个重叠的DEIRG(下图a)。circos显示染色体中预后基因的位置(下图b,c)。OS特征风险打分:

Risk score=−0.37552*JUND + 0.27513*HMGB1 + 0.74431*PIK3R2 + 0.78955*PSMD10 −0.42760*ILK+0.19689* ADM −0.176 45*SECTM1 + 0.17991*SEMA7A−0.41175*PLCG2 + 0 .83549* RAF1−0.35149*IFIH1
PFS特征风险打分:

Risk score=−0.15562* PROCR+0.15235* FABP5+0.06963* RBP4 −0.37785* RXRA+0.23565* ADM−0.20687* SECTM1+0.12620* TNFSF4 −0.63813* BECN1+0.06908* MMP9

 

随时间变化的ROC曲线显示,用于预测1年,2年和3年OS特征的AUC分别为0.830、0.830和0.824(下图a)。随后,根据X-tile确定的最佳风险评分标准,将STS患者分为高风险(n = 19)和低风险组(n = 164)。K-M曲线表明,高风险组的患者的OS较低风险组的患者差(下图b)。同样,还生成了PFS特征随时间变化的ROC曲线。用于预测1年,2年和3年PFS的特征的AUC分别为0.763、0.757和0.780(下图f)。X-tile还确定了最佳风险评分的临界值,分别将31和152例患者分为高风险和低风险组。风险评分较低的患者的PFS良好(下图g)。这些结果表明,这两个特征都是预测STS患者预后的有价值的工具。此外,为了更清楚地显示预后和基因表达模式的差异,生成了热图(下图c,h),生存分析图(下图d,j)和风险评分图(下图e,j)。
 

4.外部数据集验证预后特征

外部验证对于验证预后特征的适用性至关重要。验证中总共包括76名独立STS患者。首先,根据训练集中生成的公式,计算风险评分,包括基于OS特征的风险评分和基于PFS特征的风险评分。ROC曲线表明,验证集中对这两个特征的区分是有利的,AUC范围为0.616-0.834(下图a,f)。训练组中输入的最佳风险评分阈值用于将患者分为高风险和低风险组。K-M生存曲线显示两组之间OS和PFS有显著差异,这与训练集一致(下图b,g)。此外,还为验证集生成了两个热图,生存状态分布和风险评分分布,以说明高风险和低风险组之间的差异(图c-e和h-j)。

 

5.预后标志的亚组分析

为了研究基于DEIRG的特征适用的STS人群,在训练和验证集中基于多个临床变量的亚组中进一步进行了对数秩检验的生存分析。通过年龄(<60或≥60),性别(男性或女性),肿瘤部位(肢端或其他)和边缘状态(R0或R1-2)验证了特征的稳定性。KM生存分析表明,OS和PFS信号性质均为所有亚组的可靠预后模型,这表明我们基于DEIRG生成的预后特征对预测不同患者亚组的预后具有较强的鲁棒性。

6.基于DEIRG特征和临床参数建立列线图

作者构建了两个综合的独立临床参数的模型,以改善预后指标的临床应用。首先,作者进行了单因素和多因素Cox分析,以评估独立的OS和PFS预后变量(下图a,b)。确定了四个与OS相关的独立变量,包括风险评分,年龄,边缘状态和转移状态(下图b)。风险评分,边缘状态和转移状态被确定为与PFS相关的独立变量(下图b)。这些结果表明,两种基于DEIRG的特征均可独立用于预测STS患者的预后。

 

随后,基于独立的预后变量,建立了两个列线图以预测OS和PFS(下图a,e)。OS和PFS列线图的C指数分别为0.879(95%CI 0.832-0.926)和0.825(95%CI 0.776-0.874)。对列线图的有利校准表明,列线图预测的结果与实际观察结果高度一致(下图b-d和f-h)。
 

7.    TF‑IRG调控网络的建立

差异分析表明STS样本和正常组织样本之间有83个差异TF(下图a,b)。GO分析功能分析显示DE TFs主要参与BP,CC和MF中的共价染色质修饰,染色质和染色质结合(下图c)。KEGG通路分析表明,DE TFs主要富集于癌症,T17细胞分化和肝细胞癌的转录失调(下图d)。
 

单变量Cox比例风险模型用于识别与预后相关的DE TF,分别确定了14种DE TF与OS和PFS相关的DE TF(下图a,b)。通过皮尔森相关分析,分析了14种OS相关的DE IRG和57种OS相关的DEIRG的表达水平以及14种PFS相关的DEIRG和33种PFS相关的DEIRG的表达水平之间的相关性。构造并可视化了两个TF-IRG调控网络(下图c,d)。
 

有趣的是,在TF-IRG调控网络分析中,确定了一个关键的节点MYH11-ADM。作为DEIRG,在多变量Cox分析中,ADM被确定为与OS和PFS相关的独立基因,因此被合并到两个特征中。此外,作为DETF,MYH11与OS和PFS都显示出显著关联。因此,作者进一步研究了MYH11和ADM的表达模式以及MYH11和ADM之间的相关性。从几个数据集中检索了STS和相邻正常样品的几个基因表达谱。与正常组织相比,STS样品中MYH11和ADM的表达水平显著降低(下图a)。此外,在三个独立的数据集中也成功验证了MYH11和ADM的调控模式(下图b)。ADM和MYH11被识别为异常表达的基因,被认为是STS患者的预后生物标志物。
 

总之,从肉瘤患者数据中构建了四个基于IRG的簇和两个基于IRG的特征。簇显示与TME,免疫检查点和免疫细胞的显著关联。此外,还建立了两个TF-IRG调控网络,用以探索IRG在肉瘤中的确切作用。

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