从cfDNA的角度探索胰腺癌的拷贝数改变

大家好,今天跟大家分享的是今年6月发表在Molecular Oncology杂志(IF:6.5)上的一篇文章。主要介绍的是cfDNA(游离DNA)为肿瘤基因组图谱的研究提供了一种替代组织活检的方法,通过cfDNA的WGS(全基因组测序)来评估胰腺癌中的CNA(拷贝数改变),并确定它们的临床意义。
Genome-wide profiling of circulating tumor DNA depicts landscape of copy number alterations in pancreatic cancer with liver metastasis
循环肿瘤DNA的全基因组图谱描述了具有肝转移的胰腺癌的拷贝数变化情况
材料与方法
cfDNA的全基因组测序
研究者对从70例胰腺癌患者中收集的90份血浆样本进行了低覆盖率WGS处理(图1)。每个样本的20ng cfDNA作为文库制备的输入材料,使用Truseq Nano DNA HT样本制备试剂盒生成测序文库,并将索引代码添加到每个样本中。在纯化PCR产物之后,分析文库的大小分布并通过实时PCR定量。文库在Illumina Hiseq平台上测序,通过BWA软件将有效测序数据映射到参考人类基因组hg19上。其中,该高质量数据对读段进行了质控,以进行下游生物信息学分析。
体细胞CNA calling及TCGA数据处理
研究者使用ichorCNA方法进行了拷贝数分析和TFx(肿瘤分数)估计。具体地说,就是使用HMMcopy Suite中的工具,对基因组读段进行计数,然后对读段的计数进行归一化,以校正GC含量和可映射性偏差,再估计CNA和TFx。另一方面,研究者使用Firehose获得了原发性胰腺癌组织(n=184)的TCGA数据。体细胞CNA数据来源于Affymetrix SNP阵列,并使用预计算的分段log2比率进行分析。
基因水平的拷贝数分析
研究者使用GISTIC来进行所有基因水平的拷贝数分析。首先对cfDNA和TCGA数据进行ichorCNA分析之后得到了分段数据,经纯度和多倍性校正后再输入GISTIC。该研究的连续参数比较采用U检验,类别变量比较采用卡方检验,采用皮尔逊相关法进行相关分析,生存分析则采用Kaplan-Meier法。
结果
cfDNA的浅层全基因组测序可实现肿瘤分数的估计
基于低覆盖率WGS,在34名受试者中(48.6%)观察到了体细胞CNA。在染色体的局部性、节段性和数量上发现广泛的畸变,个体之间存在显著的异质性(图2A-D)。平均而言,这些病例中分别有23.8% 和22.8% 的基因组出现拷贝数增加和丢失(图2D)。
cfDNA的浅层WGS可以通过ichorCNA分析估算TFx。其中,队列中检测到CNA的患者的TFx值为6.1%-75.3%(图2E),而那些没有检测到改变的患者的TFx值为0。先前对当前队列中部分患者的靶向基因组测序已确定了KRAS改变,KRAS的突变等位基因片段与TFx有良好的相关性(图2F)。由于测序深度可能会影响数据解释,而以往的研究大多采用0.1×超低通测序,因此通过比较几个不同的深度来分析患者的拷贝数特征。结果表明,当按上述不同深度进行分析时,每个样本的TFx几乎相同,然而,更高的测序深度产生的基因水平拷贝数图谱的分辨率更好。
然后,研究者试图评估CNA检测或TFx>0的临床病理决定因素。结果显示,与未发现CNA的局灶性病变相比,检出CNA的30例患者均显示有肝转移。此外,TFx>0的患者血清常规肿瘤标志物如糖类抗原19-9(CA19-9)水平明显高于TFx=0的患者。而人口统计学因素、组织学和放射学特征与TFx增加无关。较高的TFx与总生存期缩短有关(图2G),并且是唯一具有统计学意义的预后因素。
cfDNA分析推测转移性胰腺癌的CNA图谱
为了确定转移性胰腺癌的染色体改变模式,研究者选择TFx>10%或含有CNA的cfDNA样本进行高置信度拷贝数调用(n=34)。另一方面,进一步纳入了TCGA数据库中原发肿瘤组织的患者,以比较原发性胰腺癌和转移性胰腺癌的拷贝数特征。结果显示,与原代相比,不论拷贝数增加还是丢失,转移性胰腺癌的基因组百分比明显增加(图3A)。总体而言,这两组之间改变的基因组区域在染色体和基因水平上基本一致,但大多数区域在转移组中显示出比原发组更高的CNA频率(图3B)。在单个基因水平上,胰腺癌相关基因的子集在转移患者中的改变频率明显更高,包括KRAS和MYC的增加,以及TGFBR2和PBRM1的缺失等(图3C-D)。
血浆和配对肿瘤组织中CNA的评估
研究者还对6例患者的血浆标本和肿瘤组织中的CNA进行了比较。在第1例中,同时获得了肝转移组织和血浆,尽管cfDNA的TFx较低,但拷贝数分布几乎相同(图4A)。其余5例是接受手术切除后发展为肝转移,对其原发性肿瘤组织的CNA和术后cfDNA进行了比较,其中2例由于肿瘤细胞密度低,ichorCNA分析估计的TFx为0。对于剩下的3对,观察到2个受试者的组织和血浆之间的轮廓有很强的一致性(图4B),但是与组织相比,cfDNA中的CNA有所增加。在最后1例中,cfDNA的CNA图谱与组织来源的DNA相比有明显的差异,其区域改变更大。这些数据暗示了在胰腺癌转移过程中,与CNA相关的基因组进化的可能性。
cfDNA图谱与肿瘤基因组进化
为了探索化疗后的基因组进化和潜在的耐药机制,研究者对14例患者进行了纵向ctDNA分析。cfDNA图谱显示TFx的动态变化与13例患者的临床反应一致。相反,对于最后1位患者,尽管化疗后肿瘤负担增加,TFx却有所降低(表1)。使用上述样本对进行化疗暴露后,全基因组范围内的拷贝数分布没有明显改变。值得注意的是,CNA的高丰度与化疗的良好反应有关,而TFx与治疗反应无关。
为此,研究者进一步验证了2个案例,分析了多个血浆样本。第1例患者最初对FOLFIRINOX(一种化疗方案)表现出良好的反应,但经过6个周期的治疗后病情恶化,这一临床背景与TFx和KRAS突变等位基因比例的动态一致(图5A)。在第2例中,FOLFIRINOX治疗后病情持续恶化,TFx的动态变化与持续升高的临床表现一致(图5B)。在这2名患者的整个治疗过程中,CNA的特征几乎相同(图5A-B)。
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