引物的纯度及使用中的常见问题最详细解读

1. 如何确定需要合成多少nmol值的引物?

根据实验目的确定。以20个碱基左右引物为例:常规PCR扩增,可选择5nmol(约合1OD),可做200次50μl标准PCR反应;基因拼接或退火后做连接,可选择5nmol(约合1OD)。

2. 如何测定引物的OD值?

合成引物的OD值是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度尽量稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。例如,验证2OD引物量是否准确,简单的做法是:加入1ml水,彻底溶解混匀后,取100μl, 加入900μl水,用光径为1cm的石英比色杯,波长260nm,此时光吸收的读数为0.2。

3. 如何通过OD值计算引物的浓度?

金斯瑞的合成报告单和引物标签上都会标识OD值与摩尔量。引物保存在高浓度的状况下比较稳定。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD值是否一致。如果不一致,请及时和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
根据国际统一标准:1OD引物干粉约为33微克; 引物的摩尔数(μmol) =质量数 / 引物分子量 =(OD数×33)/引物分子量
如您拿到1管2OD的引物,分子量是6565.3, 引物的摩尔数(μmol) =(2×33)/6565.3 ≈0.010μmol=10nmol
若您需要溶解为10μM (=10pmol/μl)的溶液,只需加入1ml无菌ddH2O或10mM pH7.5 TE缓冲液充分溶解即可。

4. 引物(含修饰)的分子量是如何确定的?

金斯瑞所提供的Oligo分子量均按照精确算法进行计算。
分子量计算公式:MW= A×313.21 + G×329.21 + C×289.18 + T×304.2 + M×301.2 +R×321.21 + W×308.71 + S×309.2 +Y×296.69 + K×316.71 + V×310.53 + H×302.2 + D×315.54 + B×307.53 + N×308.95 +16×Ns + 修饰基团分子量 – 61.96
公式中Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16,其余字母均代表相应碱基的个数。兼并碱基分子量取相应碱基分子量的平均值,如M=A/C=(313.21+289.18)/2 常用的兼并碱基代码:M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/C/T D=A/G/T B=G/C/T N=A/G/C/T
表3. 常规修饰基团分子量
修饰基团
分子量
修饰基团
分子量
5′-Biotin
447.11
3′-TAMARA
623.60
5′-(6 FAM)
537.46
3′-DABCYL
462.44
5′-HEX
744.13
3′-(6 FAM)
569.46
5′-TET
675.24
3′-Amino Modifier C3
153.07
5′-Cy5
644.7
3′-Amino Modifier C7
211.18
5′-Cy3
618.7
3′-Thiol Modifier C3
154.12

5. 如何保存引物?

引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。没有溶解的引物非常稳定,-20℃下可保存2-3年,甚至更长。溶解后的引物-20℃下避免反复冻融,可以保存至少半年以上。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD值较大,建议将溶解好的引物事先稀释为100μmol/L的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱。使用前,将浓溶液稀释成工作液(10pmol/μl或20pmol/μl)后进行实验。修饰荧光引物需要避光保存。

6. 引物在常温下运输,会降解吗?

不会降解,干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天,所以您收到的引物不会降解。

7. 如何溶解引物?

干燥后的引物质地非常疏松,开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟,或管垂直向上在桌面上轻敲几次,将引物粉末收集到管底,防止开盖时引物散失。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液,室温放置几分钟,上下混匀振荡,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。
我们的合成报告单给出了每管引物稀释为100μmol/L(即100pmol/μl)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH7.5-8.0)。

8. 已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻融,并使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

9. 如何检测引物的纯度?

实验室常见方法是用PAGE法。使用加有7 M尿素的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,碱基数小于12个的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,大于60个碱基的引物用12%的胶。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2 min)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带。)
另外纯度检测设备可以更加准确的确定引物纯度:
  • 1) HPLC(高效液相色谱):根据物质吸附作用的不同来进行梯度洗脱分离。其作用机制是:当试样进入色谱柱时,溶质分子 和溶剂分子对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附。(目前主要用的是反相柱);
  • 2) CGE(毛细管电泳仪):以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术,达到纯度分析的效果。金斯瑞已经将其作为引物质量控制的重要手段之。

10. 当引物的OD260/OD280小于1.8时,引物的纯度合格吗?

OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20 mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
碱基组成
OD260/OD280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3
2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3
1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3
1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3
1.66

11. 同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?

通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。而合成的单链DNA,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于碱基组成不同,不同引物形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。因此不能用EB染色的方法来进行定量,而应用紫外分光光度计检测。

12. 进行PAGE电泳时,长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?

这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生,长链Oligo DNA之间差别较小。主要有两个原因:
  • 1) A、G、C、T的组份不同,电泳速度不同;
  • 2) DNA的立体结构不同,电泳速度不同。

13. 能否使用Agarose凝胶电泳分析合成的引物?

对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带或无条带的现象,更无法用Agarose电泳进行定量了。

14. 有时候干燥后的引物呈黄褐色,这是DNA的本身颜色吗?

合成的引物可能呈黄褐色,白色或者透明色,这与引物的碱基组成和合成的制备过程有关,序列中A和G含量多的以及OD值大的引物通常呈黄褐色,所以呈黄褐色的引物不会对实验产生任何影响。

15. PCR扩增不出来,跟引物有关吗?

基本上不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出,扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。有些重复片段、GC含量高的片段扩增,必须采用特殊扩增手段才能扩增出来。
扩增不出,主要是下列两种情况比较常见:
  • 1) RT-PCR。很多基因通过常规RT-PCR方法是很难扩增出来的。RT- PCR成功的关键在于RT反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中的含量。
  • 2) 从基因组中扩增。一般情况下,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高,会影响反应体系中的Mg2+浓度和pH。
如果排除其它原因认为是引物问题,可以向我们反馈具体情况,我们会在检测之后给予您很好的解决方案。

16. 合成的引物进行PCR反应时无目的带,怎么办?

PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑:
  • 1) 引物和模板是否配对,同源性有多大?
  • 2) 引物本身是否有立体结构,或者二条引物之间是否形成高次结构?
  • 3) PCR反应用试剂是否能正常工作?
  • 4) PCR仪是否工作正常?
  • 5) PCR反应条件是否合适?
如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物一次。

17. PCR扩增有很强的非特异条带,说明引物有污染吗?

不能。我们曾分析过一些非特异条带,测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。因此非特异性扩增一般是模板污染(如RNA中污染基因组)或扩增条件不合适所致。

18. 如何将两条互补的单链退火形成双链?

用退火缓冲液(10mM Tris,pH7.5-8.0,50mM NaCl,1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合,总体积不要超过500μl,加热到95℃ 2min,然后缓慢冷却至室温(低于30℃)即可。退火的产物可以放在4℃待用。

19. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

连接反应的引物如果没有5’磷酸基团,连接效率相对较低,但不是完全不能成功。如果磷酸化的产物还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果以及核对引物的设计方案,如果都没有问题就要考虑改善引物退火的条件以及连接反应体系。
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