lncRNA RBP课题研究新思路

lncRNA研究可谓老生常谈了,目前lncRNA研究想要发高分文章并不简单。比如之前火翻天的lncRNA ceRNA调控机制目前已经完全套路化,全套的实验挨个做一遍才有可能发10+分的文章,什么,你还不知道全套的ceRNA实验包含哪些?那还不赶紧戳这里——完整的ceRNA机制研究应包含这些内容。而lncRNA研究中的另一主流RBP调控机制,即lncRNA通过与蛋白质形成转录复合物影响下游靶基因的转录表达也早已落入套路化的圈套。那么lncRNA研究是否再难发高分,lncRNA是否还有新的研究思路?

今天Linlin要给大家分享的这篇文章发表在Oncogene(IF=7.971)上,文章打破了传统的lncRNA RBP调控机制研究,开创了一个全新的lncRNA RBP调控机制,研究发现lncRNA可以通过促进靶蛋白的泛素化影响下游通路活性进而影响癌症转移。

研究背景

甲状腺癌是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率在所有肿瘤中排名第九。尽管甲状腺癌,尤其是甲状腺乳头状癌(PTC)患者的预后普遍良好,但淋巴结转移易引起PTC患者的复发和死亡。已有研究表明lncRNA在甲状腺癌的发生发展中起重要的作用,因此,作者想从lncRNA的角度来揭示PTC的淋巴结转移机制。

研究结果

1. PTC相关lncRNA的确定

临床PTC转移样本RNA测序后进行差异表达分析,结合TCGA预后分析以及表达量验证分析确定低表达lncRNA SLC26A4-AS1与甲状腺癌进展相关。

 

2. 体内外验证lncRNA SLC26A4-AS1的功能

体外实验:敲减/过表达SLC26A4-AS1,基质胶侵袭实验分析甲状腺癌细胞侵袭变化;

体内实验:敲减/过表达SLC26A4-AS1,分析小鼠体内甲状腺癌细胞的肺转移、脑转移和骨转移情况。

 

3. SLC26A4-AS1通过泛素-蛋白酶体途径加速DDX5的降解

接下来就是SLC26A4-AS1的机制研究了。作者假设甲状腺癌中的SLC26A4-AS1是通过RBP机制来行使作用的,为此进行了SLC26A4-AS1亚细胞定位分析。随后,利用RNA pull down结合蛋白质谱以及RNA-IP实验确定蛋白质DDX5与SLC26A4-AS1密切结合。敲减/过表达SLC26A4-AS1,DDX5蛋白水平出现相应的升高/降低。

利用蛋白酶体抑制剂MG132及蛋白合成抑制剂CHX处理,确定SLC26A4-AS1降解DDX5并非通过抑制合成途径。因此,从泛素化角度分析,转染HA-Ub以免疫沉淀甲状腺癌细胞中的DDX5,分析发现敲减/过表达SLC26A4-AS1,DDX5的泛素化出现相应的降低和增强,提示SLC26A4-AS1通过泛素-蛋白酶体途径加速DDX5的降解。

 

4. SLC26A4-AS1促进DDX5和TRIM25之间的相互作用

为确定SLC26A4-AS1加速DDX5降解的具体途径,作者利用RNA pull down分析了与SLC26A4-AS1结合的泛素化相关蛋白,确定E3 泛素连接酶TRIM25。RNA-IP结合Co-IP以及免疫荧光等实验确定TRIM25与DDX5相互作用,同时确定SLC26A4-AS1促进两者之间的相互作用关系。(SLC26A4-AS1通过TRIM25促进DDX5的泛素化,加速其降解)

 

5. SLC26A4-AS1抑制MRN基因的转录

已有研究表明DDX5能与转录因子E2F1相互作用,分析发现甲状腺癌细胞中两者同样有相互作用关系,同时分析发现E2F1调控DNA修复相关基因的表达。ENOCODE网站预测结合ChIP-qPCR实验,确定E2F1和DDX5与MRE11、RAD50(MRN组成成分,DNA修复相关基因)启动子区密切结合。敲减/过表达SLC26A4-AS1,分析发现SLC26A4-AS1主要通过降低DDX5-E2F1转录复合物的活性来抑制MRN基因的转录。

 

6. SLC26A4-AS1抑制甲状腺癌细胞的DSB修复通路

在确定DNA修复相关基因的表达受SLC26A4-AS1影响后,作者有进一步分析了DNA双链断裂(DSB)通路的变化,分析发现敲减/过表达SLC26A4-AS1,DSB通路相关的MER11、RAD50以及活化的ATM和γH2AX表达均发生变化,提示SLC26A4-AS1在抑制DSB修复信号通路和甲状腺癌转移中起重要作用。

总结

德鲁克说:“模仿本身就是创新,模仿是创新的前提,创新是成功的关键。”创新很大程度上是在原有的基础上进行改良和升华。纵观全文我们不难发现文章前半部分的研究跟常规的lncRNA研究并无差异,在确定目标lncRNA后,作者初期也是打算从传统的RBP机制着手的,只是随着实验的进行发现了一个崭新的RBP调控机制,即lncRNA SLC26A4-AS1通过招募E3泛素连接酶TRIM25促进其靶蛋白DDX5的降解,进而影响下游DNA损伤修复相关通路的活性,进而影响甲状腺癌的转移。全文并无复杂的实验设计,但对于研究的每一步都做到了有理有据,一步一步,循序渐进地向读者娓娓道来lncRNA这一新的RBP调控机制。

一条老路走的人多了,路上的风景对于大家就没有太多新意,这个时候从老路旁边开创一条新路,立马能吸引大家的眼球。科研道路上亦是如此,研究思路可以模仿,但不能照搬,适度创新还是很有必要的。

 

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