基于网络药理学和分子对接技术探讨柴银颗粒抗冠状病毒感染潜在分子机制

摘 要:目的  基于网络药理学和分子对接分析柴银颗粒抗冠状病毒感染的分子机制。方法 从TCMSP数据库中获取柴银颗粒成分,其潜在靶点以及冠状病毒作用靶点分别利用SwissTargetPrediction数据库和GeneCards数据库获取。通过绘制韦恩图发现柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在药效成分和作用靶点。潜在药效成分-作用靶点网络和潜在作用靶点的互作网络可视化由Cytoscape 3.7.0软件完成。GO功能和KEGG通路分析在String数据库中进行。潜在药效成分和关键靶点的分子对接由autodock vina 1.1.2实现。结果 发现了柴银颗粒抗冠状病毒感染的51个潜在药效成分和14个潜在作用靶点。生物信息学分析发现PI3K-Akt、IL-17等信号通路与柴银颗粒抗冠状病毒感染的分子机制相关。分子对接结果显示柴银颗粒中的黄芩苷等成分与NTRK2等靶点的亲和力强。结论 柴银颗粒中的黄芩苷、荜澄茄素、黄连碱等作用于NTRK2、PRKCα、TNF等,调节PI3K-Akt/mTOR、ErbB/Ras和IL-17等信号通路抑制冠状病毒的侵袭和复制,增强宿主免疫能力,实现抗冠状病毒感染。

冠状病毒是一种严重威胁人类和动物健康的病原体,可分为α型、β型、γ型和σ型。目前已知可感染人类的冠状病毒有7种,包括HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2[1]。2003年由SARS-CoV感染诱发的传染性非典型肺炎导致全球20多个国家共计8 000多病例报告和10%的死亡率,2012年由MERS-CoV感染诱发的中东呼吸综合征的死亡率更是达到了30%。而2019年12月—2020年4月,全球累计确诊SARS-CoV-2感染所致新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的人数已逾300万人,累计死亡人数超20万,给全球的卫生安全与经济造成了巨大的损失[2]。然而目前针对这些强致病性的冠状病毒尚无高效、特异性的疫苗和药物上市。从中国抗击COVID-19疫情的过程中可以看到中医药发挥着重要作用,这为治疗冠状病毒感染提供了一种新思路[3]

柴银颗粒是由柴胡、金银花、黄芩、葛根、荆芥、青蒿、连翘、桔梗、苦杏仁、薄荷、鱼腥草制备而成的中成药。该方中柴胡疏散风热、透邪外出,为君药;金银花、连翘清热解毒、疏散风热、消肿散结;鱼腥草、黄芩清肺泻火、消痈排脓、除湿解毒,共为臣药;葛根、薄荷辛凉解表、疏风散热;荆芥辛温,增强柴胡、葛根、薄荷的解表之功;青蒿苦寒清热、辛香透散;苦杏仁宣肺止咳化痰,为佐药;桔梗宣肺止咳且归肺经,为使药,全方具有清热解毒、利咽止咳的功效,用于上呼吸道感染外感风热证。此外,柴银颗粒还可用于治疗手足口病、流行性感冒、人禽流感、传染性非典型肺炎等传染性疾病。而且最新研究也表明柴银颗粒通过调节免疫功能对人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证具有治疗作用[4]。临床与药理学研究都提示柴银颗粒可用于抗冠状病毒感染,然而其作用机制尚不完全明确。

由于中药复方制剂组方复杂,成分众多,常规的药理学研究难以全面揭示其潜在的作用机制,而网络药理学通过构建成分-靶点-通络的多层次网络被广泛应用于研究中药的复杂机制。本研究拟采用网络药理学技术研究柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在药效成分和靶点。结合基因本体论(gene ontology,GO)功能和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析结果探讨柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在分子机制。此外,针对关键药效成分和靶点开展分子对接研究,进一步探讨柴银颗粒抗冠状病毒感染的分子机制,旨在为柴银颗粒应用于抗冠状病毒感染治疗提供研究基础和理论依据。

1  材料与方法

1.1  柴银颗粒药效成分及其靶点

从TCMSP数据库(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)中获取柴胡、金银花、黄芩、葛根、荆芥、青蒿、连翘、桔梗、苦杏仁、薄荷、鱼腥草的化学成分。设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%和类药性(drug-likeness,DL)>0.18,建立柴银颗粒的药效成分库。利用PubChem数据库(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)获取药效成分的Canonical SMILES序列,在SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库中检索,取可能性分值大于0.1且排名前15的靶点作为柴银颗粒药效成分靶点。

1.2  冠状病毒作用靶点

利用GeneCards数据库(http://www.genecards. org/),分别搜索“corona virus”“severeacute respiratory syndrome”“Middle East respiratory syndrome”和“novel coronaviruspneumonia”,将SARS、MERS和NCP的相关性分数大于30的共有靶点与“corona virus”的相关性分数大于30的靶点合并,共同作为冠状病毒作用靶点。

1.3  网络构建

对柴银颗粒成分靶点与冠状病毒作用靶点绘制韦恩图,得到柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在作用靶点。将其导入STRING数据库(https://string-db.org/),得到潜在作用靶点互作关系。随后在Cytoscape 3.7.0软件中构建柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在作用靶点互作网络和柴银颗粒潜在药效成分-作用靶点网络。利用STRING数据库对柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.4  分子对接分析

柴银颗粒的潜在药效成分和关键作用靶点的3D结构分别从PubChem数据库和PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中下载。对潜在药效成分和关键作用靶点的3D结构进行去水、加氢,转换成pdbqt格式。由autodock vina 1.1.2软件完成分子对接分析。

2  结果

2.1  柴银颗粒的药效成分及其靶点

TCMSP数据库中得到柴胡、金银花、黄芩、葛根、荆芥、青蒿、连翘、桔梗、苦杏仁、薄荷、鱼腥草的化学成分,经OB>30%和DL>0.18的筛选,共确定柴银颗粒的药效成分132个,见表1。利用PubChem数据库和SwissTargetPrediction数据库共找到柴银颗粒中95个药效成分的311个靶点。

2.2  柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在作用靶点

通过GeneCards数据库检索得到109个冠状病毒作用靶点。对311个柴银颗粒的药效成分靶点与109个冠状病毒作用靶点绘制韦恩图,得到柴银颗粒抗冠状病毒感染的14个潜在作用靶点。这14个潜在作用靶点分别为肿瘤坏死因子(Tumor necrosisfactor,TNF)、糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3 beta,GSK3β)、血管内皮生长因子A(Vascularendothelial growth factor A,VEGFA)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma,PPARγ)、β淀粉样A4蛋白(Beta amyloid A4 protein,APP)、微管相关蛋白tau (Microtubule-associated protein tau,MAPT)、神经营养性酪氨酸激酶受体2型(Neurotrophictyrosine kinase receptor type 2,NTRK2)、细胞色素P450家族19亚科A成员1(Cytochrome P450 19A1,CYP19A1)、血清素转运体(Serotonin transporter,SLC6A4)、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-Hydroxy-3-methyl glutarylcoenzyme A reductase,HMGCR)、细胞色素P450家族2亚科D成员6(Cytochrome P450 2D6,CYP2D6)、半乳糖凝集素3(Galectin-3,LGALS3)、蛋白激酶Cα(Protein kinase C alpha,PRKCα)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PLK4(Serine/threonine- protein kinasePLK4,PLK4)。将14个潜在作用靶点输入STRING数据库得到潜在作用靶点互作关系,导入Cytoscape 3.7.0软件进行可视化,得到14个潜在作用靶点的互作网络,见图1。网络分析显示该网络中共包含14个节点,66条边和182条最短路径,网络中心度为0.321,平均邻居节点数为9.429。

2.3  柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在药效成分作用靶点网络

柴银颗粒的14个潜在作用靶点与51个柴银颗粒药效成分存在相关性。将其导入Cytoscap 3.7.0软件绘制柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在药效成分- 作用靶点网络,见图2。网络分析发现该网络中共包含65个节点,71条边和2 896条最短路径,网络中心度为0.448,平均邻居节点数为2.185。

 

2.4  生物信息学分析

利用STRING数据库对柴银颗粒抗冠状病毒感染的14个潜在作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。在GO功能富集分析过程中,共确定了483个GO条目,包括多细胞生物的发育调节、凋亡过程的调控、细胞分化的调节、细胞成分生物合成的正调控和运输调节等410条生物过程;蛋白聚合、化学引诱物活性、药物结合、蛋白质均二聚活性和阴离子结合等37个分子功能;内膜系统、膜、轴突、膜结合细胞器和细胞质片段等36条与细胞组成相关功能。图3展示了显著性前15的GO功能与其涉及靶点数的对应关系。

KEGG通路富集分析显示共有44条代谢通路可能与柴银颗粒抗冠状病毒感染的分子机制相关,图4展示了显著性前20的代谢通路与14个潜在作用靶点之间的对应关系。结果显示这20条代谢通路主要富集于信号传递、免疫系统、病毒感染、神经系统和癌症等通路。既往研究表明信号传递、免疫系统相关通路与柴银颗粒抗冠状病毒感染的分子机制紧密相关。因此将重点关注MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路、Ras信号通路、VEGF信号通路、ErbB信号通路、Fcepsilon RI信号通路和IL-17信号通路在柴银颗粒抗冠状病毒感染机制中的作用,以及关键作用靶点MAPT、NTRK2、PRKCα、TNF、VEGFA、GSK3β与药效成分之间的作用。

2.5  分子对接分析

对柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在药效成分和关键作用靶点进行分子对接分析。首先从Pubchem数据库和PDB数据库中分别获取51个潜在药效成分的3D结构和5个作用靶点的晶体结构(MAPT无合适晶体结构)。NTRK2晶体结构的PDB号为4AT3,配体为LTI;PRKCα晶体结构的PDB号为3IW4,配体为LW4;TNF晶体结构的PDB号为2AZ5,配体为307;VEGFA晶体结构的PDB号为4KZN,配体为NAG;GSK3β晶体结构的PDB号为4J1R,配体为I5R。将潜在药效成分和关键作用靶点的3D结构加氢去水去配体,再由autodockvina 1.1.2软件对其进行批量分子对接分析,结果如图5、6所示。结果表明柴银颗粒中的黄芩苷(CH-02)、荜澄茄素(CH-08)、黄连碱(HQ-01)、黄豆苷元-4,7-二葡糖苷(GG-03)、蒙花苷(BH-02)和甘草苷(KXR-08)与NTRK2、PRKCα、TNF、VEGFA、GSK3β的结合能均小于与其原配体。而木犀草素(JYH-03)与PRKCα的结合能小于与其原配体、汉黄芩素(LQ-01)与NTRK2的结合能小于与其原配体。黄芩苷、荜澄茄素、黄连碱、黄豆苷元-4,7-二葡糖苷、蒙花苷、甘草苷、木犀草素、汉黄芩素为柴银颗粒抗冠状病毒感染的关键药效成分。

3  讨论

冠状病毒如SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2均对人类公共卫生安全造成了巨大的打击,然而目前缺乏抗冠状病毒感染的高效药物。实践表明中医药对冠状病毒感染具有较好的疗效,因此寻找有效抗冠状病毒的中药是一项意义非常的课题。本实验通过网络分析发现柴银颗粒中的51个关键药效成分与14个蛋白靶点可能存在效应关系。对14个蛋白靶点进行生物信息学分析得到与柴银颗粒抗冠状病毒感染机制相关的通路有MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路、Ras信号通路、VEGF信号通路、ErbB信号通路、Fc epsilon RI信号通路和IL-17信号通路,这些通路由MAPT、NTRK2、PRKCα、TNF、VEGFA、GSK3β富集得到。为了探究柴银颗粒的药效成分与蛋白靶点间的作用,分子对接实验结果表明黄芩苷、荜澄茄素、黄连碱、黄豆苷元-4,7-二葡糖苷、蒙花苷、甘草苷、木犀草素和汉黄芩素是柴银颗粒发挥抗冠状病毒感染的关键药效物质基础。

3.1  柴银颗粒药效成分抗冠状病毒的药理作用分析

网络分析发现柴银颗粒抗冠状病毒感染的51个关键药效成分主要来自柴胡、金银花、黄芩、连翘、葛根、薄荷、荆芥、青蒿和苦杏仁。研究已表明这些药材均存在一定的抗病毒活性。在我国COVID-19疫情爆发期间,小柴胡汤被推荐为治疗COVID-19的清肺排毒组方之一[5-7]。黄芪、金银花、连翘和苦杏仁等药材在抗COVID-19中使用频率也较高[8-10]。而且已有研究表明葛根、薄荷、荆芥和青蒿具有抗病毒的作用[11-14]

已有研究表明黄芩苷具有抗多种病毒(呼吸道合胞病毒、传染性法氏囊病病毒和SARS-CoV)的作用,其抗病毒机制可能是干扰病毒的复制和阻滞[15-16]。荜澄茄素具有抗炎、抗癌、抗菌等多重功效,而且研究表明荜澄茄素具有一定的抗疱疹病毒的活性[17],结合本实验结果可以推断荜澄茄素可能也具有抗冠状病毒的作用。黄连碱作为甲型流感病毒神经氨酸酶的抑制剂,为抗甲型流感病毒感染治疗药物提供补充[18]。另一方面黄连碱与氢氧化铝配伍可显著提高甲肝疫苗诱导小鼠的体液免疫应答,增强机体抗病毒的能力[19]。黄豆苷元和黄豆苷元-糖苷作为抗流感病毒或轮状病毒(RNA病毒)制剂已被申请了专利[20],而且有研究表明黄豆苷元可通过5-脂氧合酶产物的信号转导阻碍病毒复制,蒙花苷刺激外周血单核细胞产生V-delta 1+ T细胞,抑制R5-HIV病毒在CD4+ NKT细胞中的复制,这种作用呈现剂量依赖性[21]。石钺等[22]发现甘草苷是银翘散抗流感病毒的药效成分之一。学者成功利用木犀草素制备出抗登革热病毒药物和抗乙型肝炎病毒药物,其中木犀草素抑制了乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎E抗原在乙型肝炎病毒中的表达[23-24]。汉黄芩素已被报道具有抑制带状疱疹病毒、乙肝病毒和流感病毒的作用,其作用机制主要与单磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路的调控相关[25-27]。上述已有文献报道为本实验结果提供支持,即黄芩苷、荜澄茄素、黄连碱、黄豆苷元-4,7-二葡糖苷、蒙花苷、甘草苷、木犀草素和汉黄芩素可作为柴银颗粒发挥抗冠状病毒感染的关键药效物质基础。

3.2  核心靶点与抗冠状病毒感染机制的关联分析

基于网络药理学和生物信息学分析结果发现柴银颗粒抗冠状病毒感染的关键靶点包括MAPT、NTRK2、PRKCα、TNF、VEGFA、GSK3β。研究发现过表达的MAPT通过抑制自噬体-溶酶体融合显著增加SQSTM1/p62蛋白质含量,而p62的稳定过表达可显著抑制登革热病毒复制[28-29]。研究发现乙型肝炎的核心蛋白质可结合DNA启动子,诱导NTRK2的表达,但NTRK2在病毒感染过程中的具体作用尚不清晰。根据对不同信号通路的激活动力学和各种PRKCα抑制剂作用的研究,得到PRKCα的激活在呼吸道合胞体病毒感染的早期阶段非常重要,尤其是融合和复制阶段。呼吸道合胞体病毒可诱导PRKCα的磷酸化、活化和胞质到膜的转位。此外,PRKCα与病毒颗粒共定位,是呼吸道合胞体病毒与细胞膜融合所必需的[30]。因此PRKCα是抗呼吸道合胞体病毒的重要靶点。然而PRKCα是否在冠状病毒感染过程中发挥作用无文献报道。对SARS-CoV感染患者的血清分析发现感染期内IFNγ和TNF-α的水平显著升高,提高其在SARS-CoV的致病与免疫过程中可能起重要作用[31]。另一项研究则提出TNF-α抑制剂可改善SARS-CoV感染引起的免疫性肺损伤[32]。这提示TNF-α是治疗冠状病毒感染的关键药效靶点。已知血管紧张素转换酶2(ACE2)是治疗HCoV-NL63、SARS-CoV、SARS-CoV-2感染的关键靶标[33]。VEGFA则是ACE2的下游靶蛋白[34],那么对VEGFA产生的调控是否对冠状病毒感染具有防御作用值得深究。甲型流感病毒感染血管内皮细胞诱导GSK3β介导的连环蛋白在贴壁连接处的降解,使血管通透性增加,是甲型流感病毒致病的重要环节。GSK3β介导的连环蛋白降解在冠状病毒感染中的作用不得而知。

3.3  柴银颗粒抗冠状病毒感染机制分析

本研究通过网络药理学和分子对接技术揭示了柴银颗粒抗冠状病毒感染的潜在分子机制如图7所示。从生物信息学分析结果可以推断柴银颗粒抗冠状病毒感染的分子机制可能与以下通路相关:MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路、Ras信号通路、VEGF信号通路、ErbB信号通路、Fc epsilon RI信号通路和IL-17信号通路。文献调研显示从SARS-CoV感染到细胞死亡,MAPK信号通路是决定细胞死亡和存活的关键参与者。AKT信号通路对于SARS-CoV建立持续感染也是非常重要的。细胞外信号调节激酶(extracellularsignal regulated kinase,ERK)/MAPK和PI3K-AKT/mTOR信号传导的调控具有抗MERS-CoV感染的潜能,而且在病毒感染之前或之后添加一组靶向ERK/MAPK和PI3K-AKT/mTOR通路的激酶抑制剂,都能显著抑制MERS-CoV在体外的复制[35]。Chen等[36]的研究结果表明SARS-CoV的刺突蛋白会通过ErbB2触发ACE2激活,并通过Ras-ERK- AP1途径激活纤维化相关的CCL2表达,引起严重急性呼吸道综合征。已知凋亡在猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)感染中起重要作用,Omar AbdulRahman的研究则表明MAPK和VEGF等信号通路可能参与了凋亡过程,对FIPV感染起调节作用[37]。Fc epsilon RI可能参与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染过程中的抗原呈递过程和炎症反应的调控[38]。SARS-CoV和MERS-CoV都可诱导模式识别受体和IL-17信号通路激活,产生的IL-17与抗病毒信号协同增强机体促炎反应,造成机体的过度炎症,对宿主具有破坏性[39-40]

综上所述,柴银颗粒中的黄芩苷、荜澄茄素、黄连碱、黄豆苷元-4,7-二葡糖苷、蒙花苷、甘草苷、木犀草素和汉黄芩素与NTRK2、PRKCα、TNF、VEGFA、GSK3β作用,调节PI3K-Akt/mTOR、ErbB/Ras和IL-17信号通路抑制冠状病毒的侵袭和复制,增强宿主免疫能力,从而抗冠状病毒感染。

参考文献(略)

来  源:孙元芳,李冰冰,关永霞,叶士莉,严诗楷,支运霞,张贵民. 基于网络药理学和分子对接技术探讨柴银颗粒抗冠状病毒感染潜在分子机制 [J]. 中草药, 2020, 51(19):4999-5009.

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