文献解读:ceRNA网络结合免疫浸润生信分析思路

今天小编解读的这篇文章是2020年发表在Frontiers in Cell and Developmental Biology(IF:5.201)上,题目为The Construction and Analysis of ceRNA Network and Patterns ofImmune Infiltration in Colon Adenocarcinoma Metastasis。本研究通过建立ceRNA网络和分析肿瘤的免疫浸润细胞,进而构建了两个列线图,以预测COAD患者的生存和转移情况。进一步证明了其较高的AUC值。进一步发现了一些重要的ceRNA(FAS和hsa-miR-125b-5p)和浸润肿瘤的免疫细胞(T cells follicular helper和巨噬细胞M0)可能与远距离转移和COAD的预后有关。

摘要

背景:结肠腺癌(COAD)是消化系统中的一种恶性和致命性肿瘤,远端转移导致预后不良。转移特异性ceRNA(竞争性内源性RNA)和浸润肿瘤的免疫细胞可能与肿瘤的预后和远端转移有关。尽管如此,很少有研究集中在COAD中的ceRNA和免疫细胞上。

方法:可从TCGA下载COAD的基因表达谱和临床信息,并将其分为两组:有或没有远处转移的原发肿瘤。作者应用生物信息学方法来分析与转移相关的差异表达基因(DEG),并建立ceRNA网络。使用Cox分析和Lasso回归来筛选关键基因并防止过度拟合。在此基础上,建立了预后预测列线图。然后,通过CIBERSORT算法进行细胞类型识别,以筛选与COAD转移相关的重要的肿瘤免疫浸润细胞,并建立另一个预后预测模型。最终,共表达分析被用于探索ceRNA网络中的关键基因与重要免疫细胞之间的关系。使用多个数据库和初步的临床标本验证来测试细胞和组织水平上关键生物标志物的表达。

结果:作者筛选了1个显著的差异表达的lncRNA,1个显著差异表达的miRNA,8个与生存相关的免疫浸润细胞,5个与远处转移相关的免疫细胞。此外,还识别了与COAD转移相关的3对重要的生物标志物:T cells follicular helper和hsa-miR-125b-5p,巨噬细胞M0和hsa-miR-125b-5p,巨噬细胞M0和FAS。 多维验证和初步临床标本验证也支持上述结果。

结论:本研究中,作者发现了一些重要的ceRNA(FAS和hsa-miR-125b-5p)和浸润肿瘤的免疫细胞(T cells follicular helper和巨噬细胞M0)可能与远距离转移和COAD的预后有关。 列线图可以协助科研人员进行临床管理。
流程图

结果简述

1. 差异表达基因的识别

从TCGA-COAD数据库中共识别出14447个lncRNA,2588个miRNA和19660个mRNA(下图A,B)。使用log(FC)> 1.0或< -1.0和FDR <0.05作为临界值,总共203个蛋白编码基因(117个下调和86个上调)(下图C,D),22个lncRNA(21个下调和1个上调的蛋白(下图E,F)和18个miRNA(9个下调的蛋白和9个上调的蛋白)。

2.    ceRNA网络构建及生存分析

作者构建一个由13个基因组成的ceRNA网络(4个lncRNA,4个miRNA和5个mRNA)。所有基因组成4对lncRNA–miRNA对和5对miRNA–mRNA对(下图A)。Cox回归和Kaplan–Meier方法用于检验结肠癌生物标志物与预后的相关性,在ceRNA网络中仅识别出两个重要基因(SLC2A3, hsa miR-125b-5p)(下图B,C)。
ceRNA网络中的13个基因都整合到Cox比例风险模型中以评估其预后价值(下图A)。基于该模型,建立了列线图以预测COAD患者的3年和5年总生存率(下图B)。Lasso回归用于测试这些基因在建模中的意义(下图C,D)。应用了ROC和校准曲线(下图E,F),并显示出可接受的精度(3年生存期的曲线下面积(AUC):0.693;5年生存期的AUC:0.673)。

3.    转移性和非转移性COAD之间的肿瘤浸润免疫细胞的组成

通过CIBERSORT算法评估COAD组织中重要的肿瘤浸润免疫细胞的组成。直方图(下图A)和热图(下图B)可能表明T cells CD4 memory resting, T cells CD8, Macrophages M0 和Macrophages M2 在原发性肿瘤和远处转移组织中明显高表达,它们可能在结肠癌中发挥重要作用。此外,Wilcoxon秩和检验表明T cells follicular helper (P = 0.038), B cells naive (P = 0.040), Tregs (P = 0.033), Macrophages M0 (P = 0.034) 和Eosinophils (P = 0.028) 在远处转移和原发性结肠腺癌之间的免疫细胞比例有显著差异(下图C),T cells CD4 memory activated (P = 0.030), Plasma cells (P = 0.019), T cells CD8 (P = 0.035), Dendritic cells activated (P = 0.048), Dendritic cells resting (P = 0.048), Macrophages M1 (P = 0.010), Mast cells resting (P = 0.043)和Mast cells activated (P = 0.025) 在免疫细胞级分上有明显差异(下图D)。

4.  基因和免疫细胞对预后和远端转移的共表达分析

首先,构建重要肿瘤免疫细胞的Cox回归模型(下图A)。作为基因模型,在多变量模型的基础上,利用列线图显示了14种重要免疫细胞对3年和5年总生存率的影响(下图B)。此外,ROC和校准曲线可以显示列线图的辨别力和一致性(3年生存的AUC:0.708;5年生存的AUC:0.780)(下图C,D)。
使用在有或没有远端转移的COAD样本中使用预后肿瘤浸润免疫细胞进行共表达分析(下图A)。T cells follicular helper (M stage: P = 0.001; Staging: P = 0.009), Macrophages M0 fraction (T stage: P = 0.035; N stage: P = 0.040), dendritic cells activated (N stage: P = 0.009) 和monocyte (Kaplan– Meier survival analysis: P = 0.041) 均显示与临床特征显著相关(下图B–G)。
最后,下图说明了ceRNA网络中关键分子和免疫细胞中关键分子的重要共表达模式。T cells follicular helpe和hsa-miR-125b-5p, 巨噬细胞M0和hsa-miR- 125b-5p和巨噬细胞M0和FAS(R = 0.370,P <0.001),这些可以描述关键生物标志物与距离转移COAD之间的显著关系。

5.  初步临床标本验证

IHC的结果(20个COAD样本,包括10个有转移和10个无转移)表明,FAS,NES,CD3,CD68和BCL6的蛋白质在诊断为有转移和无转移的COAD中有显著差异(下图A)。非参数测试的结果也证实了这些差异具有统计学意义(下图B–H)。热图显示了ceRNA网络中FAS,NES,CD3,CD68,BCL6和关键miRNA(miR-320a-3p,miR-320a-5p和miR-125b-5p)的表达水平(下图I)。此外,尽管样本量受到限制,但CD68(巨噬细胞标记M0)和FAS,CD68和NES显示出共表达趋势(下图J)。

6.    多维验证

下图总结了包含关键ceRNA和免疫细胞的推测机制图。

在两个独立的数据集中,FAS和NES均具有明显的患者无转移生存(MFS),如下图所示。
此外,将具有585个COAD样品的GSE39582用于CIBERSORT的验证(下图A)。结果表明巨噬细胞M2对COAD具有明显的预后价值(下图B)。此外,通过多变量Cox回归模型的公式计算每个COAD患者的风险评分。通过风险线和风险散点图显示了所有COAD患者的风险评分分布(下图C–D)。Kaplan-Meier生存曲线表明,风险评分对COAD患者具有预后价值(下图E)。并说明了ROC曲线(AUC = 0.698)和多元Cox回归模型的辨别力(下图F)。
本研究通过建立ceRNA网络和分析肿瘤的免疫浸润细胞,进而构建了两个列线图,以预测COAD患者的生存和转移情况。进一步证明了其较高的AUC值。此外,预测列线图可能为医生提供大量有用的综合临床信息,从而改善COAD患者的个体管理。
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